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样品蛋白质总糖脂肪水分灰分得率 紫菜蛋白83.44.30.013.56.228.7 表1紫菜蛋白主要成分 Table 1Main components of Porphyra Yezoensis protein（%） 混合酶法制备紫菜蛋白降压肽 周存山余筱洁 * 杨虎清仲山民 （浙江林学院农业与食品科学学院浙江临安311300） 摘要采用混料设计，研究混合酶配比，优化水解条件；HPCE法测定血管紧张素转换酶（ACE）抑制率。 研究混 合酶法制备紫菜蛋白降压肽的优化工艺。建立混合酶比例与降压活性的数学模型，确定最佳酶配比：Alcalase碱 性蛋白酶38.1%，Neutrase中性蛋白酶31.9%，胰蛋白酶30.0%。 最佳水解条件：底物质量分数5%、加酶量3%、 pH 8.5、温度50 、时间90 min。 混合酶较单一酶制备降压肽的ACE抑制率提高了44.33%86.45%。 关键词条斑紫菜； 蛋白质； 降血压肽； 混料设计 文章编号1009-7848（2010）01-0156-05 高血压是一种动脉血管压力升高的慢性疾 病，是导致中、老年人死亡的罪魁祸首之一，是发 展中国家的又一场“流行病”1。血管紧张素转换酶 （ACE） 抑制剂是降血压药物中发展最快的一类， 但合成药物有一些不良反应，如引发蛋白尿、白细 胞减少和停药综合症等2。来源于食物蛋白的降压 肽没有上述副作用， 且仅对高血压患者起降压作 用，对正常人无降压作用，同时还具有免疫调节等 功能3。 为此，开发天然降压肽产品成为降血压药 物的研究热点。 自1965年Ferreirra4首次从巴西蝮蛇蛇毒中 分离出ACE抑制肽以来，人们在许多食品的蛋白 质中发现ACE抑制肽，如牛乳酪蛋白、沙丁鱼肉、 酸奶、大蒜、大豆、麦胚、玉米等。 然而以海藻蛋白 为原料进行降压肽的研究起步较晚。 条斑紫菜营 养丰富，蛋白质含量高达40%，适于制备降压肽5-6。 长期以来， 降压肽的制备工艺是在单一酶法 筛选基础上进行的，但单一酶作用位点较单一，导 致蛋白水解度低且水解时间长等问题。为此，部分 学者尝试物理场促进法， 即采用超声波技术辅助 提高酶解效率以及酶组合法， 结果表明多种酶协 同作用有一定的优势。 该研究仅定性研究多种酶 组合因素，未做定量模型优化研究5，7。在降压活性 体外模拟检测方面，紫外分光光度法最为简单、实 用，HPLC法最常用且较为精确， 而HPCE法更方 便、快速、精确8。 本文以紫菜蛋白为原料，ACE抑制活性为指 标， 采用Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白 酶、胰蛋白酶进行混料设计，建立数学模型，优化 酶的配比。 在此基础上优化水解条件，确定最佳工 艺。 1材料与方法 1.1材料 Alcalase蛋白酶（50 ，pH9.0）、Neutrase中性 蛋白酶（45 ，pH7.0）、胰蛋白酶（pH8.0，50 ），丹 麦NOVO公司； 血管紧张素转换酶（ACE），Sigma 公司；马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL），Fluka公司；马 尿酸 （Hip）， 中国医药集团上海化学试剂公司； Folin-酚试剂，Sigma公司； 其它化学试剂均为国 产分析纯。 条斑紫菜蛋白（紫菜：江苏省南通市兰波实业 有限公司）由碱提酸沉法5获得，其主要组分见 表1。 收稿日期：2009-02-28 基金项目： 国家自然基金资助项目（30940058）；浙江省科 技厅资助项目（2007F70044，2008C32028） 作者简介： 周存山，男，1979年出生，博士，副教授 通讯作者： 余筱洁 Vol 10 No 1 Feb 2 0 1 0Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology 中 国 食 品 学 报 第10卷第1期 2 0 1 0年2月 第10卷 第1期 1.2试验方法 1.2.1水解液制备将紫菜蛋白配制一定质量分 数，搅拌，调整pH、温度，加酶，水解一定时间，95 保温10 min，离心（5 000 r/min，20 min），收集上 清液，测定抑制率。 1.2.2测 定 方 法蛋 白 质 测 定 ：GB/T50095- 2003； 水分测定：GB/T50093-2003； 脂肪测定： GB/T50096-2003；灰分测定：GB/T50094-2003； 总糖测定：苯酚-硫酸法9。 HPCE法测定降血压活性8：石英毛细管柱， 磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH8.3），进样（压力4.8kPa， 时间3s），分离电压20kV，检测波长228 nm。 降血 压体外测定原理见图1和图2，通过HHL在ACE 的作用下生成马尿酸及HL模拟体内紧张素反应 过程。 1.2.3混合酶配比的确定采用混料试验设计， 对紫菜蛋白进行水解研究。 固定底物质量分数 5%，酶添加量为紫菜蛋白总量的2%，温度50 ， pH8.0，水解60 min。 以抑制率为指标，优化3种酶 的配比组合。 I= Sa-Co Co 100%（1） 式中，I样品对ACE的抑制率；Sa对 照组马尿酸峰面积；Co添加样品后马尿酸峰 面积。 1.2.4混合酶水解条件优化为确定混合酶最佳 水解条件，对混合酶的温度、底物质量分数、加酶 量、pH值采用四因素三水平L9（34）正交试验设计。 以抑制率为指标做试验， 设计因素水平方案见 表2。 水解时间由单因素试验获得，固定温度、底物 质量分数、加酶量、pH，时间30240 min，以抑制率 为指标。 2结果与讨论 2.1回归模型建立 自1958年Scheffe提出单纯型格子设计以 来，混料设计理论及应用都有了很大的发展。 在混 料设计中， 每个分量的贡献都表示成混料的比 例10。 用Y表示试验指标，X1、X2、Xn表示混料 系统中n种成分各占的百分比。 混料设计就是在 混料条件 Xi0（i1，2，n），X1X2Xn1（2） 或除条件式（2）之外，再加上其它条件的约 束，合理地安排试验，得出关于Y的回归方程，使 得分析方法简单、准确，便于计算和推测最佳混料 比。 混料条件式（2）决定了混料回归设计中的数 学模型， 它不同于一般回归设计中采用的数学模 O C GlyHisLeu ACE O C Gly+HisLeu 图1以Hip-His-Leu为底物的ACE活性测定原理 Fig.1Principle of ACE activity determination with substrates of Hip-His-Leu 80 60 40 20 0 80 60 40 20 0 mAU 1 2 3 4 1 2 3 4 mAU 04567 4567 时间/min时间/min 注：1. ACE；2. Hip-His-Leu（HHL）； 3. His-Leu（HL）；4. Hip A： 对照；B： 样品 图2HPCE法测定ACE活性图谱 Fig.2Chromatogams for the determination of ACE activity with HPCE 水 平 底物质量分数 （A/%） 加酶量 （B/%） pH （C） 温度 （D/） 1517.545 2728.050 3938.555 表2L9（34）正交试验设计因素水平 Table 2Factors and levels of L9（34）orthogonal design 混合酶法制备紫菜蛋白降压肽157 中 国 食 品 学 报 2010年第1期 型。 一般回归设计中采用的模型是多项式，而混料 回归设计不能采用多项式， 否则会因混料条件式 （2）的限制而引起信息矩阵退化。 混料回归设计中 常采用被称为Scheffe多项式的数学模型。 表3列出了采用混料设计进行混合酶研究的 试验方案、 试验结果及其预测值。 对响应值进行 Scheffe多项式（不完全三次式）拟合分析，得回归 模型方程： I=0.43X1+0.33X2+0.31X3+0.39X1X2+0.35X1X3+ 0.36X2X3+3.02X1X2X3（3） 结果表明， 不完全三次回归模型极显著 （P 0.0001），决定系数（R-Squared=0.9624）和校正决 定系数R-Squared（Adj）=0.9373都在0.9以上，说 明模型能够很好的拟合各指标与混合酶比例。 2.2混合酶配比 依据表3中的试验结果，利用式（3）的数学模 型，将区间设定在-1.414，1.414，同时配比和为 1，进行规划求解，获得优化酶配比：Alcalase碱性 蛋白酶38.1%，Neutrase中性蛋白酶31.9%， 胰蛋 白酶30.0%。 2.3验证试验 为检验模型预测值与试验值的差异， 根据优 化条件做试验，结果表明，抑制率为58.9%，而由 式（3）计算的理论值为60.7%，说明回归模型优化 的混合酶比例具有实际意义。 2.4混合酶水解条件 混合酶水解条件不同于单一酶，为此，进行正 交设计优化，试验设计及结果见表4。 从极差R值 的大小可以看出各因素对抑制率的影响大小依次 为：底物质量分数、加酶量、pH和温度。 根据极差 分析结果可知，较优水平为A1B3C3D2，即底物质量 分数5%、加酶量3%、pH8.5、温度50。 时间单因素研究结果如图3所示。 随时间的 延长，抑制率先增加后减小，90 min时抑制率达到 最高值74.3%。 0.5000.0000.5000.4350.458 0.3310.3350.3340.5720.591 1.0000.0000.0000.4210.430 0.0000.0001.0000.2890.310 0.1700.6640.1660.5030.494 0.1690.1620.6700.5040.478 0.0001.0000.0000.3350.330 0.0001.0000.0000.3140.330 0.0000.5000.5000.3930.410 0.5000.5000.0000.4770.478 1.0000.0000.0000.4180.430 0.8330.0000.1670.4860.459 0.0000.5000.5000.4090.410 0.0000.0001.0000.3230.310 0.5000.5000.0000.4710.478 0.6630.1690.1670.5250.543 试验值预测值 X1X2X3 抑制率 表3混料设计试验安排及结果与预测值（100%） Table 3Program and results of Mixture experimental design with the and predicted values（100%） 编号ABCDI/% 1111163.3 2122264.4 3133367.8 4212362.4 5223165.5 6231266.3 7313262.6 8321361.7 9332162.1 k165.16762.76763.76763.633 k264.73363.86762.96764.433 k362.13365.40065.30063.967 R3.0342.6332.3330.800 表4水解条件的正交试验L9（34）设计及结果和分析 Table 4Design，results and analysis of L9（34） orthogonal test on the conditions of hydrolysis 158 第10卷 第1期 2.5对照试验 混合酶制备降压肽与对照单一酶法 （试剂推 荐 条 件 ：Alcalase碱 性 蛋 白 酶50 ，pH 9.0； Neutrase中性蛋白酶45 ，pH 7.0； 胰蛋白酶pH 8.0，50 ）的区别：混合酶法采用优化条件，单一 酶法除pH和温度采用酶推荐条件外， 其它条件 相同，结果如表5所示。 对照试验结果：混合酶比 单一酶作用抑制率提高44.33%86.45%。 3结论 1）采用混料设计，建立了3酶系比例与抑制 率活性之间的数学模型，并进行配比优化，模型预 测具有实际意义。 2） 最佳酶配比：Alcalase碱性蛋白酶38.1%， Neutrase中性蛋白酶31.9%，胰蛋白酶30.0%。 3）通过正交试验优化的水解条件：底物质量 分数5%、加酶量3%、pH 8.5、温度50 、时间90 min。 4）混合酶法比单一酶作用抑制率活性提高44.33% 86.45%。 80 70 60 50 40 30 0306090 120 150 180 210 240 270 抑制率/% 时间/min 图3水解时间对ACE抑制率的影响 Fig.3Effect of hydrolysis time on ACE inhibitory activity 酶抑制率 胰蛋白酶39.551.25 Neutrase蛋白酶46.242.27 Alcalase蛋白酶51.091.18 混合酶73.742.14 表5混合酶与单一酶对照试验结果（平均值SD，%） Table 5Results of Controlled trial with mixture enzymes and single enzyme（MeanSD，%） 参考文献 1 Masuda O. 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