指纹图谱及高效液相.ppt

指纹图谱文献查阅总结,查阅文献名称,中药指纹图谱在中药质量控制中的应用王乐 高效液相色谱数字化定量指纹图谱评价维C银翘片的中药 组分物质均一性 邵艳玲 地黄基于HPLC指纹图谱的质量评价及种质资源利用研究曹建军 人参药材HPLC指纹图谱和高端保健品多维指纹图谱的研究苑若瑶 六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究高新彪 黄芎抗栓胶囊指纹图谱的研究_冯艺戎 高效液相色谱法同时测定黄芎抗栓胶囊中5种大黄成分的含量_韩燕全 仙鹤草质量控制方法的研究_丁蓓蓓,查阅文献名称,用HPLC指纹图谱对复方丹参片的信息质量控制研究孙国祥 复方丹参片指纹图谱的质量评价研究曾令杰 高效液相色谱法测定六味地黄浓缩丸特征图谱及4种主要成分的含量罗云 中药色谱指纹图谱研究及化学计量学方法的应用徐小娜 青藏高原红景天药材的HPLC指纹图谱_李维卫 红景天活性成分及药理作用_袁瑜 青藏高原红景天药材的高效液相色谱指纹图谱研究_吴启勋 以上为主要查阅文献，还有一部分为选择性浏览或与以上文献有重复内容故没有全部列出。,查阅内容总结,1.对指纹图谱的初步认识及对其在中药学领域应用的了解 2.根据今后实验方向重点了解高效液相色谱指纹图谱在中药学领域的应用 3.中药材用高效液相色谱法分析时具体操作方法 4.高效液相色谱指纹图谱在具体成药质量控制方面的应用,指纹图谱的概述,中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。,中药指纹图谱研究意义,色谱、波谱以及光谱技术是实现指纹图谱对复杂样本质量控制的依托；较于传统质量控制模式，指纹图谱体现的是复杂样本整体化学成分的完整谱图，即复杂样本内在化学成分的整体性。由于中药存在许多的次生代谢产物造成中药中各种化学成分组成的不确定性，同一品种中药的化学指纹图谱会具有模糊性。这两者作为指纹图谱的基本属性，它体现的不是个体的特异性而是同一种中药群体的相似性，即中药内“共有特征”，能体现指纹图谱的相似性；指纹图谱的解析不强调图谱的精密计算和完全相同，而是强调图谱的准确辨认和相似。利用指纹图谱作为中药质量控制技术，并不要求检测出中药中每一组分的化学结构，但要求其图谱应具有“指纹”的特征，即要求其具有专属性。同时，作为中药质量控制的有效方法之一，中药的化学特征指纹图谱需具有重现性和可操作性。,指纹图谱在评价中药质量中的作用,1. 观察指纹图谱的整体特征，鉴别生产前原料真伪，对原料药进行质量控制用以保证其质量的稳定。 2. 可区别药材不同部位，还可对不同采摘期的药材进行分析，确定最佳生长年限和采收季节。 3. 指纹图谱可以考察商品药材及成药的质量，建立各药材或成药的标准指纹图谱，可用于判断药材优劣，区分正品与伪品。也可区别不同产地的药材。,指纹图谱在评价中药质量中的作用,4. 可追踪制剂中某些化学成分的变化，可利用指纹图谱考察中药中某些成分的稳定性。 5. 可检测原料与成品之间及成品的批次间质量稳定性。可规范生产工艺保证产品稳定性（对中间体或半成品进行指纹图谱）。 指纹图谱技术利用中药特征指纹图谱的差异实现中药真伪鉴别；而利用中药特征指纹图谱主要特征峰的含量或比例实现中药质量的有效控制。,指纹图谱中，各色谱峰所代表的物质的光吸收曲线不可能相同，而物质含量检测的理想条件是获得待测物质的光吸收曲线峰值或最大值，因此，固定单波长下精确的检测色谱峰所代表的多种物质含量是不可能的。 如果可以获得指纹图谱中个色谱峰的代表物质光吸收峰值，就可精确测定这些物质的含量，而二极管阵列检测器的应用使同时精确测定的多种物质的含量成为可能。,中药指纹图谱技术分类,（1)色谱法，如薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC) 、高效毛细管电泳(CE)和高速逆流色谱(HSCCC) ,等； （2)波谱法，如红外光谱(IR) 和紫外-可见光谱(U-Vis)、X射线衍射法以及核磁共振谱(NMR)等； （3)色谱联用技术，如气相色谱-质谱联用(GC-MS) 和液相色谱-质谱(LC-MS) 等； （4)其他方法：电化学法、化学振荡技术、分子生物学方法等。 色谱法和色谱-质谱联用技术因其实用性较强而成为众多研究方法中获取中药指纹图谱信息的主要手段。 不同检测方法会使分析的精密度、峰型、保留时间和分离度（即分离出的成分多少）有所不同。,中药的高效液相指纹图谱分析方法,中药高效液相指纹图谱分析是以样品间色谱峰图共有峰的不同峰面积和保留时间为对象进行比对分析的。分析时大多结合药材，制剂有效成分所在部位以相应溶剂提取该部位有效成分，而有些制剂或药材用一种溶剂不能完全获取全部代表性有效成分时则采用多色谱指纹图谱分析。以不同溶剂提取获得多个色谱图。,指纹图谱测定实验步骤,1.供试品及对照品的制备 2色谱条件的选择 3.方法学考察 线性关系的考察 精密度实验 稳定性试验 重现性试验（保证相对保留时间的RSD1%,相对保留面积的RSD3%） 加样回收率实验 4.指纹图谱的建立和共有指纹图谱峰的指认,样品的溶液制备选择方法 1.提取方法的选择（冷浸，回流，超声，微波等），需要对实验图谱比较不同提取液和提取方法对色谱峰的影响来选择合适的方法,最终还需要对选择的溶液制备方法进行优化。 2.不同溶剂提取对色谱峰的影响 确定溶剂及提取方法后，观察不同浓度溶剂对色谱峰影响 和峰型影响，在保证提取时所有组分峰出现并稳定的同时要确保样品溶液与初始流动相的性质尽量保持一致，这样可保证峰多的同时畸形峰也少。 HPLC流动相的选择 乙腈-水，甲醇-水，乙腈-磷酸水溶液，乙腈-乙酸水溶液 流动相组分溶液浓度对色谱峰影响 在选择流动相体系若酸度较大时，峰型好的同时还须考虑色谱仪酸承载能力,开始方法建立,首次HPLC分离较好的实验条件 色谱柱 C18、C8 5m 150.46cm 流动相 甲醇-水， 甲醇-甲酸水（？不太确定） 流速 1.52.0ml/min 温度 3545 样品量 体积25L 重量 100 g,色谱柱的冲洗和预平衡：,先用纯溶剂冲洗平衡柱子，再使用自己所选用的流动相冲柱子。 若上次实验中有盐或对离子试剂需要先用含水流动相（实验用的流动相）冲洗后再用纯溶剂平衡柱子。防止影响下次实验。 常用溶剂： 酸：醋酸，磷酸，三氟乙酸（用于酸性化合物） 胺：三乙胺（用于碱性化合物） 醋酸、三乙胺（复杂化合物）,若用硅胶色谱柱应保持流动相PH在3.08.0之间。 柱子过夜要冲洗掉盐类和缓冲液，以纯流动相保存。 为了避免漏检样品中可能存在的化合物,建议用洗脱能力非常强的流动相,做第一次预实验,然后按照一定速度(20%)降低强溶剂的比例。,确定方法的有效性,在精密度、方法可重复性及样品稳定性分析中由五次进样所得共有峰的峰面积和峰保留时间的相对标准偏差来确定。 由此确定仪器和进样精密度如何，提取方法，仪器状态，色谱条件是否适用。并确保溶液在规定温度条件下48小时内稳定。,分析方法的评价方式,精密度：取样品一定量按试验方法制备样品溶液，24小时内连续进样5次，分析仪器及进样的精密度。 重复性：取5份同样量的样品，按试验方法（制备方法及色谱方法）进样分析，测分析方法的可重复性。 精密度：取同一样品溶液室温下放置，48小时内进样分析五次，分析样品溶液在室温下的稳定性。,图谱峰的确认,共有指纹峰的来源确认是将复方成药提取液的 HPLC 图分别与其组方中各单味药提取液 HPLC 图相比较。通过比对各指纹峰保留时间可知特征峰所代表的药效成分且确定该峰是那个药材中成分的对应峰。 复方成药HPLC 指纹图谱中，找出一个最大峰（各谱中测得均较稳定）为参照峰( S 峰) ，计算各色谱峰保留时间 和保留峰面积与同一图谱中 S 峰的保留时间和保留峰面积比值，得到的相对保留时间和相对峰面积，进行指纹图谱峰的标定。,三 压力降,同一支色谱柱的渗透性（压力降）或反压力应该相似。 用球形微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估算： P=3000L/（t0dp2） 式中P为压力（psi），L为柱长（cm），为流动相粘度（cp），t0为死时间，dp为微粒的直径。 新的色谱柱使用纯溶剂（甲醇、乙氰）冲洗时要记录压力，这是色谱柱很重要的指标,3-4 色谱柱问题的解决方案,在建立HPLC方法时三种重要的问题 1保留值与分离度发生变化；2谱峰拖尾；3色谱柱寿命短 （一）保留值的重现性是建立良好HPLC方法的重要问题。解决的建议如下： 与色谱柱有关：1 开始时选一支好的色谱柱，硅胶基质酸性弱，纯度高，整个应用中都使用同一固定相、粒度及柱尺寸。2 预先保存色谱柱，或联系能连续提供同种柱的公司。,用良好的流动相条件，包括PH、缓冲溶液种类及浓度、添加剂，尽量减小硅胶基质的“次级作用”。,流动相的配制方法：20mMol磷酸钠缓冲液：HCN（9：1）9体积的磷酸钠缓冲液加1体积的HCN溶液混合。脱气方法应一致 缓冲溶液的配制方法：天平定量称量，定容到一定体积最准。如需控制PH值时应使用酸度计，添加好的酸碱。 色谱柱的冲洗和预平衡：,正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗,参考图5-23，5-24 “污物”在柱进口处积聚，柱压高等问题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，反冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲醇（可加少量水）；反相柱可用异丙醇加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%