木薯渣生产菌体蛋白的研究.pdf

木薯渣生产菌体蛋白的研究 管军 军 1 ,张同斌 2 ,崔 九红 1 ,李亚军 1 ( 1. 河南工业大学生物工程学院, 河南郑州450001;2. 河南工业大学理学院, 河南郑州450001) 摘要 目的 研究利用固态发酵技术生产菌体蛋白的适宜菌种及条件。 方法 以木薯渣为主要原料, 选用霉菌单菌种、 酵母菌单菌种 及二者混菌种为供试菌种, 通过固态发酵生产菌体蛋白, 并以混合菌为菌种进行4 因素正交试验。 结果 混菌种发酵所得蛋白含量高 于单菌种; 在混菌发酵培养基中添加无机氮源, 产物中蛋白含量显著提高; 正交试验表明, 各因素对生产菌体蛋白影响顺序为: 发酵温 度 接种比例 培养基含水量 发酵时间;最佳发酵条件组合为: 温度30 ,时间5 d, 培养基含水量60% , 酵母菌和霉菌接种比2 1, 其 蛋白质含量可达15 .68 % ,较原料有明显的提高。 结论 木薯渣混菌固态发酵后蛋白质含量明显增高,作为饲料有较高的应用价值。 关键词 木薯渣;菌体蛋白;混菌发酵;固态发酵 中图分类号 S816 .4 文献标识码 A 文章编号 0517 - 6611(2008) 22- 09556 - 03 S tudy on Bacteria l P rote in Produ cedfromCassava R esidu e GUAN Jun -junet a l ( College of B ioengineering, H enan U n iversity of T echnology , Zhengzhou , H enan 450001) Abstrac t O bjective T he aimto study the su itable strain and cond ition for p roducing the bacterial protein by solid state ferm en tation techn ique . M ethod T he cassava residue w as u sed as raw m aterial andthe single strain of m ildew and m icrozym es and their m ixed bacterium w ere taken as tested strains to p roduce bacterial p rotein th rough solidferm en tation andthe orthogonal test w ith 4factors w as conducted . Resu lt T he protein con tent obtained by m ixed bacteriumferm en tation w as h igherthanthat bysingle bacteriaferm entation . W henthe inorgan ic n itrogen sou rce w as added in to the ferm en tation m ed ium w ith m ixed bacteriumthe protein con ten t in ferm en tation product w as sign ifican tlyincreased . The orthogonal test show ed that the effect of each factor on p roducing bacterial proteinin order w as ferm en tationtem peratu re inocu lationratio m oisture content o f m ed ium ferm en tation tim e . The best com bination forferm en tation cond itions w ere :ferm en tationtem perature of 30 ,ferm en tationtim e of 5 days , 60% m oistu re con ten t of m ed ium, the inocu lation ratio of m ildewand m icrozym es being 2 1 , under w h ich, 15 .68 % of p rotein con ten t cou ld be obtained, beingincreased noticeably com pared w iththe raw m ateria l . Conclu sion The cassava residue w ith m ixed bacteriumth rough solid state ferm en tation cou ldincrease the p rotein con ten t sign ifi- can tly, so it had higher application value w henit w as taken as the feed. K ey words Cassava residue ; Bacterial p rotein ; M ixed bacteriumferm en tation ; Solid state ferm en tation ? 基金 项目 河南 工业大 学引进 人才 专项基 金 ( 150220) 。 作者 简介 管军 军 ( 1975 -) , 男, 湖北 蕲春人 , 博士 , 副教 授, 从 事 饲料 蛋白 资源的 研究与 开发 。 收稿 日期 2008-05-14 木薯是世界三大薯类之一, 广泛栽培于热带和亚热带地 区1- 3。在我国南亚热带地区, 木薯是仅次于水稻、 甘薯、 甘 蔗和玉米的第五大作物, 它在作物布局、 饲料生产、 工业应用 等方面具有重要作用, 已成为广泛种植的主要的加工淀粉作 物。木薯渣是木薯被提取了淀粉以后的下脚料混合物3, 含 有纤维素、 脂肪、 蛋白质及矿物质等丰富的营养物质, 是良好 的饲料资源。目前, 虽然国内外对木薯渣在菌体蛋白、 酒精、 菌业等方面有所报道4- 8, 但在工业上用量甚少, 大量的木 薯渣都被废弃, 造成浪费与环境污染。笔者以木薯渣 为原 料, 接入一定的微生物菌种进行发酵, 通过大量培养菌种细 胞以获得菌体蛋白含量较高的菌体蛋白饲料, 为工业上大量 应用提供一定的技术基础, 从而缓解了蛋白饲料短缺的问 题, 扩大了木薯渣应用范围。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 木薯渣。产地广西南宁, 由江苏畜牧兽医职业技术 学院提供。 1.1.2 菌种。霉菌、 酵母菌, 河南工业大学生物工程学院实 验室保藏。 1.1.3 培养基。霉菌固体种子培养基。麸皮培养基, 麸 皮 水=1 1 。固态发酵培养基。以木薯渣为主料, 加入疏 松剂和氮源。 1.1.4 仪器与设备。SW - C J -2F 双人双面净化工作台;SPX - 150B 生化培养箱;LDZX -50KBS 立式压力蒸汽灭菌锅;722 型 分光光度计; 凯氏定氮仪;TDL -5A 离心机;JY 92-II 超声波细 胞粉碎机。 1.1.5 主要试剂。硫酸铵, 尿素, 磷酸二氢钾, 硫酸铜, 双缩 脲试剂, 氢氧化钠, 酒石酸钾钠, 乙醇, 浓硫酸, 浓盐酸, 酪蛋 白等均为分析纯。 1.2 试验方法 1.2.1 样品蛋白质溶液的制取。取样( 发酵产品) 研磨 细胞破碎 稀碱提取 过滤醇沉 离心配制蛋 白质 溶液。 1.2.2 单菌种发酵和混菌种发酵对比试验。试验中, 木薯 渣可通过不同的菌种发酵生产菌体蛋白饲料。结合相关文 献9, 分别选用霉菌单菌种、 酵母菌单菌种及二者混菌种为 供试菌种, 加入7 % 的尿素, 按接种量为2 % 、 接种比例为2 1 接种于发酵培养基中, 在自然pH 值、 培养基含水量60 % 、 温 度30 的条件下发酵5 d , 然后在65 条件下烘干至恒重, 分析测定。 1.2.3 混菌种固态发酵条件的确定。影响固态发酵的条件 因素有无机氮源添加量、 温度、 时间、 接种量、 接种比例、 培养 基含水量等10- 14, 其中接种 比例为酵母菌 与霉菌的比值。 先对各因素做单因素试验, 然后在单因素试验的基础上选择 合适的因素和水平做正交试验。 1.2.4 项目测定。木薯渣中粗蛋白含量的测定: 凯氏定氮 法( GB 6433-02) ; 发酵产品 中蛋白 质含量 的测定: 双缩脲 试 剂法5。 1.2.5 数据处理。以上所有试验都需做3 5 次平行试验, 取其平均值; 正交试验进行极差分析。 2 结果与分析 2.1 单菌种发酵和混菌种发酵的比较 试验用木薯渣含粗 蛋白1.92% , 分别采用霉菌单菌种、 酵母菌单菌种及二者混 菌种对木薯渣进行发酵, 发酵后木薯渣的蛋白含量分别为: 安徽农业科学,Jou rna l of A nhu i A gri .Sci .2008,36(22) :9556 - 9558 ,9596 责任编辑 罗芸 责任校对 李洪 霉菌发酵的为9 .48% , 酵母菌发酵的为8.12 % , 混菌发酵的 为10 .98 % , 表明经过固 态发酵后, 木薯 渣蛋白含量明 显提 高; 混菌种发酵效果要优于单菌种发酵, 这是因为混菌发酵 时, 多菌体系中微生物生长状况优于单菌发酵体系, 且混菌 种对木薯渣营养成分的利用率较高, 起到霉菌和酵母菌优势 互补、 混合增效的目的。 2.2 混菌种固态发酵条件 2.2.1 无机氮源添加量。从生长角度看, 霉菌可利用很多无 机氮和有机氮, 而木薯渣中无氮浸出物含量较高, 含氮量较 低, 而微生物生长需要充足的氮源, 所以在发酵时应添加必 要的氮源; 另一方面加入无机氮源并通过微生物代谢使其转 化为蛋白质, 能够使蛋白质的绝对数量获得增加, 可直接有 效地提高木薯渣中蛋白质含量。根据预试验, 选取尿素和硫 酸铵作为供试氮源, 结果如图1 、 2 所示。由图1、 2 可知, 添加 尿素优于添加硫酸铵, 且添加7 % 尿素时蛋白含量较高。 图1 添加硫酸铵氮源对产物中蛋白质含量的影响 F ig.1 E ffe c ts o f add in g am m on iumsu lph a te a s n itrog en sou rc e on pro te incon ten tinth eprodu c ts 图2 添加尿素氮源对产物中蛋白质含量的影响 F ig.2 E ffec ts of add in g u reaa s n itrogensou rc e onpro te incon ten tin th e produ c ts 2.2.2 温度。发酵温度是影响产物蛋白质含量的一个重要 因素。由于微生物生长是其体内一系列酶促反应的具体体 现, 酶促反应速度的大小直接表现为微生物生长速率的快 慢: 一方面, 温度升高, 细胞中的生物化学反应速率和生长 速率加快, 另一方面, 微生物体内的酶促反应有一定的温度 范围, 超过该范围, 微生物的机体代谢与生长繁殖将不同程 度地受到影响。该试验中, 改变混菌种的发酵温度, 而培养 基组成以及其他发酵条件不变, 通过所获得的蛋白质含量 来恒量温度对混菌种生长的影响, 结果表明( 图3) , 当发酵温 度为30 时, 产物蛋白含量较高。 2.2.3 培养基含水量。在固体发酵中, 培养基含水量要适 当, 水多使料粘结, 不利于通气; 水少则不利于孢子萌发及菌 体的生长代谢。培养基含水量可影响产物蛋白质的含量, 如 图4 所示, 当培养基含水量为60% 时, 产物蛋白质含量较高。 图3 温度对产物中蛋白质含量的影响 F ig.3 E ffec ts o f tem pera tu re on pro te incon ten tinth e produ c ts 图4 培养基含水量对产物中蛋白质含量的影响 F ig.4 E ffe c ts o f w a te r c on ten tinth e m ed iumon pro te incon ten t in th e produ c ts 2.2.4 接种量。接种量也是影响产物中蛋白质含量的一个 因素, 其用量的大小影响到微生物的生长周期, 接种量大, 有 利于形成菌体的群体生长优势, 缩短迟滞期; 接种量过小, 则 可能使菌体培养的迟滞期过长; 但接种量也不宜过大, 接种 量过大一方面增加前期工作量, 另一方面可能会因带入过 多的代谢产物而影响菌体的生长。由图5 可见, 当接种量为 2 % 时, 产物的蛋白质含量最高。 图5 接种量对产物中蛋白质含量的影响 F ig.5 E ffe c ts o fin oc u la tionquan tityonpro te incon ten tinth eprod- u c ts 2.2.5 接种比例。混菌在协同发酵过程中, 各自发挥其主 要作用, 只有在适宜的比例下, 才会使蛋白质含量增高。接 种比例过大或过小都会影响蛋白质含量。如图6 所示, 当酵 755936 卷22 期 管军军等 木薯渣生产菌体蛋白的研究 母菌与霉菌接种比例为2 1 时产物的蛋白质含量最高。 图6 接种比例对产物中蛋白质含量的影响 F ig.6 E ffe c ts o f in oc u la tion proportion on pro te in con ten t in th e produ c ts 2.2.6 发酵时间。微生物培养时, 生长时间过短, 达不到理 想的蛋白质含量; 生长时间过长, 则生产成本变大, 且容易滋 生杂菌。该试验中, 每隔1 d 取样1 次, 测定其蛋白质含量, 结果如图7 所示, 固体发酵前2 d, 产物中蛋白质含量处于较 低水平; 从第3 天开始, 蛋白质含量呈迅速上升之势, 发酵第 5 天达到最高, 再继续培养, 蛋白质含量又有所下降, 这与微 生物本身的性质有关。 通过单因素试验, 了解了产物中蛋白含量与各个因素的 图7 时间对产物中蛋白质含量的影响 F ig.7 E ffec ts o f tim e on pro te incon ten tinth eprodu c ts 关系以及变化趋势。其中, 无机氮源添加量、 温度、 培养基含 水量、 接种量以及发酵时间五因素对产物中蛋白含量的影响 均与文献 16 所述一致。而接种比例对蛋白质含量的影响 与文献16 稍有差异。经过分析, 可能的原因主要有: 菌种 存在一定的差别; 培养基成分有差别; 接种方式以及顺序不 同等; 具体原因有待进一步深入研究。 2.3 混菌种固态发酵条件的优化 通过上述试验, 以混合 菌为菌种, 发酵温度、 时间、 培养基含水量和接种比例为4 个 因素, 进行4 因素3 水平的正交试验, 试验设计见表1 。 表1 发酵条件正交试验因素水平 T ab le 1 Fac to rs andleve ls o f fe rm en ta tionc on d ition o rthogon a l te st 水平 L evels 因素F actors A 发酵温度 F erm en tationtem p eratu re B 发酵时间 d F erm en tat iont i m e C 培养基含水量% W ate r con ten tin m ed ium D 菌种接种比例 S trainin ocu la tion p rop ortion 1254501 1 2305602 1 3356703 1 表2 固态发酵工艺条件优化的正交试验结果 T ab le 2 O rthogon a l te st re su lts o f so lid -sta te fe rm en ta tioncond ition s op ti- m iza tion 组号 G roup code 因素F actors ABCD 蛋白质含量 P ro teincon ten t % 1 1 1 1 1 1.53 212226.14 313333.07 421233.45 522319.40 6231214.96 731328.34 832135.76 933213.26 K110.7418.2117.7414.19 K232.7021.3022.2529.44 K317.3621.2920.8117.17 k13.586.075.914.73 k210.907.107.429.81 k35.797.096.945.72 R7.321.031.515.08 极差分析结果表明( 表2) , 以蛋白质含量为指标主次因 素顺序为:A D C B, 最佳工艺参数组合为A2D2C2B2, 即温 度30 , 菌种接种比例2 1 , 培养基含水量60% , 发酵时间5 d。对最佳组合条件进行了验证试验, 结果其产物中蛋白质 含量为15.68% , 与正交试验的结果相一致。 3 结论 (1) 混菌种发酵蛋白质含量优于单菌种发酵; 单菌种发 酵时, 霉菌较酵母菌适应木薯渣环境。 (2) 在混菌发酵培养基中添加无机氮源, 产物中蛋白含 量有显著提高。 (3) 通过正交试验, 混菌种固态发酵的最佳工艺条件为 温度30 , 发酵时间5 d; 培养基含水量60% , 接种量2 % , 酵 母菌和霉菌接种比例为2 1。 因此, 初步断定, 木薯渣混菌固态发酵后, 其蛋白质含量 增高, 有作为饲料应用的前景, 当然还需深入研究其工艺条 件以及其营养成分, 进行动物饲养试验等, 以确定其作为饲 料的应用价值。 参考文献 1 中国热带农业科学院,华南热带大学.中国热带栽培学 M .北京:中国 农业出版社,1995:213. 2 胡忠泽, 刘雪峰.木薯渣饲用价值研究 J . 安徽技术师范学院学报, 2002(4) :12- 13. 3 白元生.饲料原料学 M .北京:中国农业出版社,1992:92- 95. 4 陈桂光,庞宗文.木薯渣生料发酵生产单细胞蛋白的研究 J .粮食与饲 料工业,1997(6) :23- 24. ( 下转第9596 页) 8559 安徽农业科学 2008 年 图1 不同溶剂浸提一点红的提取效率 F ig.1 Th eex tra c tione ffic ien c yo fth ee x trac tsfromEm ilia sonchifo- lia w ith d ifferen t so lven ts 表1 提取物化学分析 T ab le 1 Th ech em ica l an a ly s is o f th eex trac ts 反应类型 Reactiontyp e 试验现象 T est ph enom ena 结果 Resu lts 与碱反应A lka li react ion 浅黄色, 加热黄 色不变 可能有黄酮类化合物存在 铅盐沉淀反应L ead sa lt sed im en ta tion reaction 黄绿色沉淀可能有黄酮类化合物存在 A lC l3试验A lC l3test 浅黄色斑点, 紫 外灯下显蓝色 可能有黄酮类化合物存在 硅钨酸试验S ilicotun gstic acidtest 灰白色沉淀可能有生物碱存在 浓硫酸试验Concen trated su lfu ric acidtest 紫色可能有生物碱存在 浓硝酸试验Concen trated n itric acidtest 棕红色可能有生物碱存在 2.2 一点红不同溶剂提取物的抑菌作用 在抑菌圈试验 中, 抑菌圈越大表示该菌对药物的敏感性越高, 反之越低; 若 无抑菌圈, 则说明该菌对药物具有耐药性。由表2 可知, 一 点红甲醇、 乙醇、 丙酮和乙醚浸提物对金黄色葡萄球菌均具 有抑菌作用 ( 抑菌圈 10 mm ) , 其中乙醚浸提物的抑菌作用 最强, 乙醇次之, 乙酸乙酯提取物作用最弱。由表3 可知,5 种提取物对大肠杆菌的抑菌作用均较弱, 其中乙醚提取物的 抑菌作用稍强, 乙醇提取物的抑菌作用次之, 丙酮、 乙酸乙酯 提取物的抑菌作用最弱。试验结果表明,5 种溶剂中乙醇的 提取效率较高, 且抑菌作用较好。 3 小结 由化学检识结果可知, 一点红5 种溶剂浸提物中均含有 黄酮和生物碱, 其中甲醇提取效率最高, 但抑菌性较差, 乙醚 抑菌性虽然最高, 但提取率较低。综合提取、 抑菌结果, 乙醇 的提取效率较高, 提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑 制作用均呈现出中度敏感, 为提取的最佳溶剂。 表2 一点红不同溶剂提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用 T ab le 2 Th einh ib ition o f th e ex trac ts from E . sonchifolia w ith d iffe ren t so lv en ts to Staphylococcus aureus 组别 G roup 抑菌圈直径m m D iam eter of bacteriosta tic circle 123平均A verage 空白对照B lank con tro l- 硫酸链霉素22242624.0 S trep tom ycinsu lfate 甲醇提取物M eth ano l ex tract18121414.7 乙醇提取物E th ano l ex tract16161816.7 丙酮提取物A ce ton e extract18161215.3 乙酸乙酯提取物14121012.0 E xtract w ith eth yl ace ta te 乙醚提取物A eth er ex tract20181818.7 注: -表示无抑菌圈, 为滤纸直径 ( 6 mm ) 。下 同。 N ote : -m eanthe diam e ter of filter paper(6 mm) , w ithou t no bacteriostatic circle . The sam e as below. 表3 一点红不同溶剂提取物对大肠杆菌的抑制作用 T ab le 3 Th einh ib ition o f th e ex trac ts from E . sonchifolia w ith d iffe ren t so lv en ts to Escherichia co li 组别 G roup 抑菌圈直径m m D iam eter of bacteriosta tic circle 123平均A verage 空白对照B lank con tro l - - - - 硫酸链霉素 15 17 18 16.7 S trep tom ycinsu lfate 甲醇提取物M eth ano l ex tract10989.0 乙醇提取物E th ano l ex tract10121011.0 丙酮提取物A ce ton e extract7977.6 乙酸乙酯提取物 -8 -6.7 E xtract w ith eth yl ace ta te 乙醚提取物A eth er ex tract16141213.0 参考文献 1 M UK O KN, O H IR I F C. Ap relim in arystudyonthean t i - in flam m a to ryp rop - ert ies o f Em ilia sonchifo lialeaf ex tractsJ . F ito te rap ia, 2000,71:65- 68. 2 罗超坤.广藿香水提物的抗菌实验研究 J . 中药材,2005,8(28) :700- 701. 3 王玲,张富宝.中药大黄提取色素的抑菌作用研究 J .食品工业科技, 2000(6) :27- 28. 4 SR IN IV ASAN K K, SANK ARASU BRAM AN IANS. Ch em ical investigat ion o f Em ilia sonchifo liaJ .F itoterap ia,1980,51(5) :241- 243. 5 李秀信,王荣花,杨秀萍.一点红黄酮成分的分析及含量测定 J .西北 植物学报,2003,23(4) :671- 673. 6 CHEND, ROD