牛奶加热过程中初始美拉德反应的程度.pdfVIP

浙 江 农 业 大 学 学 报 23( 4) : 437441, 1997 Journal of Zhejiang Agricultural U niversity 收稿日期: 1996-05-15 浙江省自然科学基金资助项目 牛奶加热过程中初始美拉德反应的程度 茅林春1 陈忠明1 李卫芬2 金良俊3 ( 1 浙江农业大学食品科学与技术系, 杭州 310029; 2 浙江农业大学饲料研究所, 杭州 310029; 3 温州旭洋饮料有限公司, 浙江省乐清 325600) 摘 要 牛奶在加热过程中由于发生美拉德反应使有效赖氨酸的数量明显减少.E- 脱氧-果糖- 半 乳糖-赖氨酸(Lactuloselysine)是美拉德反应初始阶段产生的一种束缚态赖氨酸. 传统的酸解处理 会造成该化合物分解. 本试验研究用蛋白酶水解牛乳蛋白质, 再用高效液相色谱法直接测定E- 脱氧 -果糖- 半乳糖-赖氨酸. 根据美拉德反应的动力学原理, 建立了在未知初始赖氨酸含量的情况下计 算初始美拉德反应程度的数学模型. 该模型对于在 110 下处理时间不超过 90min的牛奶比较准 确可靠. 关 键 词 美拉德反应; 牛奶; 高效液相色谱法; 赖氨酸 中图分类 T S252. 42;TS252. 7 Mao Linchun1; Chen Zhongming1; Li Weifen2; Jin Liangj un3(1 Dep t. of Food Sci. , Zhejiang A - gricultural University,H angzhou310029,China; 2Institute of Feed Sci. ,Zhejiang A gricultural University, H angz hou 310029, China; 3 Wenzhou Xuyang Beverage Co. LTD. , Yueqing 325600, China) The extent of the early Maillard reaction in heat treated milk. Journal of Zhejiang Agricultural U ni- versity, 1997, 23(4) : 437441 Abstract Loss of available lysine due to Maillard reaction was serious in heat treated milk. The major form of blocked lysine after early Maillard reaction was lactuloselysine(E-deoxylactu- losyllysine) which is broken down on acid hydrolysis. Direct determination of the lactuloselysine with HPLC after complete enzymatic hydrolysis was presented.A mathematical model calculating the extent of the early Maillard reaction without knowledge of the initial lysine value before treat- ment was established based on the kinetic of the Maillard reaction.T he model was proved to be re- liable for milk samples heated at 110 for shorter than 90 min. Key words M aillard reaction; milk; HPLC; lysine 乳制品经过加工或长期贮藏, 就有大量 的氨基酸( 尤其是赖氨酸) 被束缚或破坏, 导 致营养价值明显下降.这种情况通常是由氨 基酸与还原糖之间发生的反应, 即美拉德反 应( Maillard reaction) 1所引起. 美拉德反应 的化学历程可分为初始、 高级和最终 3 个阶 段. 在初始阶段, 氨基酸与还原糖缩合产生 Amadori 化合物( 1-氨基-1-脱氧-2-酮糖) ; 在 高级阶段和最终阶段, Amadori 化合物进一 步转变成其它化合物, 并最终产生类黑精. Amadori 化合物中的一部分氨基酸分子, 尽 管能被盐酸解离, 但生物体内的消化酶则不 能解离 2, 3. 因此, 这种氨基酸被称为无效氨 基酸. 轻度加工或适当贮藏的食品中, 美拉德 反应往往只停留在初始阶段. 因此, 初始美拉 德反应程度应是判断这些加工或贮藏因素对 食品营养品质影响程度的重要依据, 也是评 价食品营养状况的主要指标. 现有测定美拉德反应程度的方法多基于 测 定 有 效 赖 氨 酸 ( available 或 reactive lysine) 含量的变化 4, 5. 而最能精确表示初始 美拉德反应程度的指标应该是 Amadori 化 合物的产量.但国际上至今尚难于直接测定 该化合物, 现有的 Furosine 法只是一种间接 估算方法 6, 7, 其精确性容易受许多因素的影 响 2, 4. 本文报道用多种蛋白酶消化牛乳蛋白 质, 再用自动氨基酸分析仪( 高效液相色谱 法) 直接测定酶消化液中的 Amadori 化合物 ( E -脱氧- 果糖-半乳糖-赖氨酸) 的方法, 并在 不知赖氨酸初始含量的情况下, 建立了计算 初始美拉德反应程度的数学模型. 1 材料与方法 1. 1 实验试剂 NA -乙酰赖氨酸, Q -甲苯磺酸, 胃蛋白酶, 链霉蛋白酶 E, 氨肽酶 M, 氨酰基脯氨酸( 二 肽) 酶和乳糖均购自美国 Sigma 试剂公司. 1. 2 牛奶热处理 试验用鲜牛奶取自浙江农业大学动物科 学院畜牧场. 将鲜奶装入 10 ml 具塞试管中, 在 110 的烘箱内放置 30120 min, 然后 迅速流水冷却到室温.各重复 3 次. 1. 3 LacLys 标样的制备 LacLys ( E -脱氧-果糖-半乳糖-赖氨酸) 标样的 制备参考Henle 等 8方法, 在 10 ml 试管中加 入 10 mg Na-乙酰赖氨酸和 70 mg 乳糖和 5 ml 0. 1 mol/ L 磷酸缓冲液( pH 6. 86) , 轻摇试 管使试剂充分溶解, 然后将试管加塞, 在 112烘箱内放置 4 h. 待试管冷却至室温后, 取出 1 ml 反应液分别与5 ml 6%甲苯磺酸混 合, 在 112下分别水解 0. 54 h. 水解液用 0. 1 mol/ L 氢氧化钠中和后, 再用 0. 2 mol/ L 柠檬酸钠缓冲液( pH 2. 20) 稀释定容. 1. 4 酶水解 参考 Henle 等 8 方法, 称取 6 mg 奶样 品, 分别加 1 ml 0. 02 mol/ L 盐酸、 50 Ll 胃蛋 白酶液( 100 L g/ 50 Ll 0. 02 mol/ L 盐酸) 和少 许麝香草酚. 将试管加塞后在37 的水浴中 保温 24 h. 然后在试管中, 再加入 250 Ll 2 mol/ L T ris 缓冲液 ( pH 8. 20) 和 50 L l 键霉 蛋白酶 E 液( 100 g/ 50 Ll 2 mol/ L T ris 缓冲 液) , 再将试管保温 24 h. 第二次保温后再加 入 20 Ll 氨基肽酶 M 和 10 Ll 氨酰基脯氨酸 ( 二肽) 酶液, 然后进行第三次 24 h 保温.经 上述处理的水解液经冷冻干燥后溶解于 5 ml 0. 2 mol/ L 柠檬酸钠( pH 2. 20) 缓冲液 中, 滤纸过滤后即可在氨基酸分析仪上测定. 1. 5 氨基酸测定 用 830 型自动氨基酸分析仪( 德国, KNAUER 公司) 测定氨基酸, OPA 检测, Hyipersil ODS ( C18) 色谱柱( 4250 mm) , 粒径 5 Lm, 激发波长 330 nm, 发射波长 445 nm. 柱温45 . 缓冲液成分及洗脱顺序见表 1.比较赖氨酸标准量计算 LacLys 的含量. 表 1 洗脱顺序 Table 1 Separation prog ramme( % ) 时间T ime( min)0121415. 517. 518. 5212533374045 Buffer A9590808065626245400095 B 510202035383855601001005 A:pH7. 0sodium acetate/methanol= 39/ 11; B:pH7. 0sodium acetate/methanol= 1/ 3;Flow rate of buffer: 1ml/min 438 浙江农业大学学报 23 卷 2 结果分析 2. 1 LacLys 标样的合成和检测 LacLys( E -脱氧-果糖-半乳糖-赖氨酸) 是 初始美拉德反应产生的一种稳定的化合物. 根据图 1 机制合成的 LacLys 标样, 经氨基 酸分析仪检测发现, 紧随赖氨酸峰之后出现 了一个新的氨基酸峰, 其保留时间约 2 325 s ( 图2) . 随着甲苯磺酸水解时间的增加, 该峰 的高度相应上升. 因此, 可以确认该氨基酸为 LacLys. CH NH CO CH3 COOH (CH2)4 NH2 A - Acetyl-lysine + Lactose CH NH C O CH3 COOH ( CH2)4 NH CH2 CO CHOH CH HCOH CH2OH Galactose A - Acetyl-E - deoxy- lactulosyllysine + T oluenesulphonic acid +H2O -CH3COOH CH H2NCOOH (CH2)4 NH CH2 CO CHOH CH HCOH CH2OH Galactose E- deoxy-lactulosyllysine (Lactuloselysine) 图 1 E-脱氧- 果糖- 半乳糖- 赖氨酸的合成 Fig. 1 T he synthesis of lactuloselysine 图 2 氨基酸色谱 Fig. 2 Chromatograms of standard(A)and lactuloselysine synthesised according to the scheme of Figure1,hydrolysed with toluenesulphonic acid for30min(B)or4h(C) 2. 2 初始美拉德反应程度测定 由于 LacLys 是牛奶中美拉德反应初始 阶段产生的唯一稳定的产物( 图 3) 2, 9 , 因此 可以成立: 初始美拉德反应程度( % ) = LacLys 中的赖氨酸量 赖氨酸初始含量 100(1) 本试验模拟人体肠道的消化环境, 用多 种蛋白质水解酶消化牛乳蛋白质, 除了 La- 439 4 期 茅林春等 牛奶加热过程中初始美拉德反应的程度 cLys 中的赖氨酸不能被消化解离之外, 其余 蛋白质肽链上的游离态赖氨酸都能被消化解 离出来. 因此, 从这种酶消化液中测出的赖氨 酸属有效赖氨酸.因此, 赖氨酸初始含量 = 有效赖氨酸含量+ LacLys 中的赖氨酸量 (2) 合并方程( 1) 和方程( 2) , 得到 初始美拉德反应程度( % ) = LacLys 中的赖氨酸含量 有效赖氨酸含量+ LacLys 中的赖氨酸含量 100(3) 表 2 结果表明, 随着牛乳热处理时间延 长, 更多的赖氨酸与乳糖反应, 产生 LacLys, 从而使有效赖氨酸的数量明显减少, 牛奶的 营养品质明显下降.Henle 法计算的初始美 拉德反应程度明显高于其余二种计算方法. 在 90 min 的加热时间内, 采用方程( 3) 计算 的初始美拉德反应程度与有效赖氨酸法计算 的结果之间没有显著差异. 这一结果证明, 即 使在不知道样品处理前的赖氨酸初始含量的 情况下, 通过方程( 3) 也能比较准确地计算出 初始美拉德反应的程度.但加热时间达到 120 min 时, 方程( 3) 计算的结果明显低于有 效赖氨酸法计算的结果. 这种现象表明, 在加 热 120 min 的牛奶中美拉德反应已进入高级 阶段或最终阶段, 部分 LacLys 已转变成其 它物质. 用方程( 2) 估算的赖氨酸初始含量与实 际初始含量也十分接近( 表 2) . 该结果也证 实 LacLys 是牛奶加热时美拉德反应最初产 生的一种稳定的化合物. Galactose- glucose + Lysine R R Addition compound N- substituted glycosylamine Schiff base Enol form Galactose-fructoselysine R R Browning Enzymatic hydrolysis Galactose- fructoselysine (Lactuloselysine) 图 3 美拉德反应初始阶段以及 E - 脱氧-果糖- 半乳糖-赖氨酸的产生 Fig. 3 Early stage of the Maillard reaction with the formation of lactuloselysine 表 2 牛奶中初始美拉德反应的程度 T able2 Extent of the early Maillard reaction in milk 加热时间 Heat time (min) 有效赖氨酸 Available Lys (mg/g protein) L acLys (mg/g protein) 初始美拉德反应程度 Ex tent of the early Maillard reaction By Henle By available Lys By equation( 3) 估算的初始 赖氨酸含量 Calculated initial Lys (mg/g protein) 078. 73000078. 73 3072. 5121. 1011. 55a7. 90b8. 01b78. 83 6070. 3526. 4614. 45a10. 64b10. 12b78. 27 9068. 8135. 0718. 63a12. 60b13. 24b79. 31 12062. 7947. 2325. 23a20. 25b18. 38c76. 93 Mean separation done by LSR test at P= 0. 05, same letters within a line indicate no significant difference; 1001. 5LacLys/ ( Available Lys+ 1. 5LacLys) ; 100- ( 100Available Lys/initial Lys) . 440 浙江农业大学学报 23 卷 3 讨 论 美拉德反应在乳制品的加工或贮藏中十 分普遍, 美拉德反应不仅造成氨基酸破坏, 而 且反应产生的许多产物会干扰蛋白质的效 率, 甚至对生物体产生毒性作用 10, 11.本试 验改变了盐酸消化蛋白质的传统方法, 采用 蛋白酶水解法, 从而避免了美拉德反应初始 产物( E -脱氧-果糖-半乳糖-赖氨酸) 的分解. 由于该产物上仍保留游离的 A -氨基, 因此用 氨基酸分析仪结合特定条件, 不仅可测定有 效赖氨酸含量, 而且可同时测定 E -脱氧-果糖 -半乳糖- 赖氨酸的数量. Henle 等 8 首 次 提出 用 变异 赖 氨 酸 ( modified lysine) 占总赖氨酸的百分率来表 示初始美拉德反应的程度. 实际上, 变异赖氨 酸除了束缚在 Amadori 化合物上的赖氨酸 之外, 还包括反应高级阶段和最终阶段被破 坏的那部分赖氨酸; 而且, 盐酸并不能把所有 Amadori 化合物中的赖氨酸都解离出来, 因 此, 总赖氨酸含量( 盐酸水解法测出) 一般低 于其初始含量. 这是导致 Henle 法计算的初 始美拉德反应程度明显偏高的主要原因.据 此, 本试验建立的计算初始美拉德反应程度 的方法具有更高的准确性.本方法特别适合 于未知样品处理前赖氨酸初始含量的情况, 因而比现有的有效赖氨酸法更为实用. 致 谢 本试验是在德国基尔 大学人类 营养和食品科学研究所研究工作的基础上进 行的. 试验中得到了该研究所主任 Erbers- dobler 教授和韩国昌原大学食品营养系李京 惠博士的指导和帮助, 特此深表谢意! 参考文献 1 Hodge J E. Chemistry of browning reactions in model systems. J Agr Food Chem, 1953, 1: 928 943 2 Finot P A,Deutsch R,Bujard E.The extent of the maillard-reaction duringtheprocessing of milk, Prog Food Sci. Nutr. , 1981, 5: 345355 3 Erbersdobler H F. 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