富士苹果多酚氧化酶的提取及特性的研究.pdf

收稿日期: 2009203202 基金项目:河南省教育厅自然科学基金(2007550009) 作者简介:宋莲军(1769 - ) ,女,河南郑州人,副教授,博士,从事食品科学研究工作。 富士苹果多酚氧化酶的提取及特性的研究 宋莲军,唐贵芳,赵秋艳,乔明武 (河南农业大学 食品科学技术学院,河南 郑州 450002) 摘 要:以富士苹果为试验材料,邻苯二酚为底物,对多酚氧化酶(polyphenol oxidase , PPO)的提取条件及 特性进行了研究。结果表明,富士苹果PPO的最佳提取条件为pH值514的磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲液(含20 gL - 1的 PVPP和215 gL - 1 Triton X2 100) 、液料比115 mLg- 1; PPO的最适温度为30,最适pH值为410。单独 使用对PPO活性抑制能力最强的是L2半胱氨酸,其次是抗坏血酸,草酸和柠檬酸抑制能力较弱。复合抑制剂的 最优组合为01900 gL - 1抗坏血酸、51000 g L - 1柠檬酸、31750 g L - 1草酸、11000 g L - 1 L2半胱氨酸,对PPO的抑 制率达97183 %。 关键词:富士苹果;多酚氧化酶;提取;特性;抑制率 中图分类号: TS255154 文献标识码: B 文章编号: 052829017(2009)0420789204 苹果属蔷薇科苹果属,是世界4大水果之一。 2006年我国苹果总产量2 606万t ,占世界总产量的 3718 %。苹果深加工是苹果产业增产创收的重要途 径。但是苹果在加工过程中易发生酶促褐变,导致 产品质量下降,严重影响到产品的销售和企业经济 效益。多酚氧化酶(polyphenol oxidase , PPO)是引 起果蔬酶促褐变的重要原因之一, PPO能催化内源 性多酚物质氧化成醌,再聚合成黑色素,从而使苹 果及其制品发生褐变 1 。因此,苹果PPO的研究 具有重要意义。目前很少有学者对富士苹果PPO 的提取条件进行优化和对相关特性进行深入研究。 作者以磷酸盐为缓冲液,邻苯二酚为底物,采用分 光光度法确定了从富士苹果中提取PPO的最佳条 件,并研究了该酶的作用条件,设计单因素和正交 试验筛选出抑制富士苹果PPO活力的复合抑制剂, 从而为进一步研究果蔬酶促褐变控制方法提供参考 依据。 1 材料与方法 111 试验材料 供试用富士苹果采自河南省灵宝市金农果园, 4 贮藏。化学物品邻苯二酚、三氯乙酸、磷酸氢 二钠、抗 坏 血 酸(ascorbic acid , Vc)、柠 檬 酸 (citric acid , CA)、草酸(oxalic acid , OA)、L2半胱 氨酸 (L 2cysteine , LC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、 Triton X2100等均为分析纯。 112 主要仪器与设备 高速组织捣碎机, Neofuge 23R型台式高速冷 冻离心机, UV22000紫外可见分光光度计, SWB2 2000恒温水浴摇床。 113 试验方法 11311 PPO的提取 将已预冷的苹果清洗、去皮、去核、切块,加 入已预冷的磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲液(含20 gL - 1 PVPP和215 gL - 1 Triton X2100 2 ) , 在高速组 织捣碎机中匀浆1 min , 8层纱布过滤,取滤液离 心10 min (4,10 000 rmin - 1 ) , 得到上清液即为 PPO粗酶液,于4 保存备用。以上操作步骤均在 4 下进行。 11312 PPO活性的测定及抑制率的计算 反应体系包括1 mL磷酸缓冲液、1 mL 011 molL - 1邻苯二酚和 1 mL粗酶液,在特定的温度下 保温10 min ,立即加入2 mL 200 gL - 1 三氯乙酸, 快速摇匀,用UV22000紫外可见分光光度计测定 420 nm下的吸光值 3 。吸光值(A420)越高,说明 PPO的活性越大。 本实验用抑制率来评价抑制剂对酶活的抑制能 力,抑制率越高,则抑制酶活的能力越强。抑制率 的计算:抑制率( %)=(未加抑制剂的样液的吸 光值-添加抑制剂的样液的吸光值) 未加抑制剂 2009年第4期789 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 的样液的吸光值 100。 11313 液料比对PPO提取效果的影响 使用磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲液为提取液,添 加2 % PVPP和012 % Triton X2100 ,控制每克苹果 中分别添加110、115、210、215 mL的提取液(表 示液料比为110、115、210、215 mLg - 1 ) , 提取 PPO ,室温下测酶活,优选最佳液料比。 11314 pH值对PPO提取效果的影响 以pH值014为间隔,分别配制pH值为510 718的磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲液,添加2 % PVPP 和012 % Triton X2100 ,提取PPO ,室温下测酶活, 优选最佳pH值。 11315 温度对PPO活性的影响 以5 为间隔,分别将邻苯二酚和上述提取的 PPO提取液在560 下保温,然后测定酶活。 11316 pH值对PPO活性的影响 以pH值015为间隔分别调整缓冲液pH值215 715 ,测定PPO提取液的活性。 11317 单一抑制剂对PPO活性的影响 取1 mL一定浓度的抑制剂对1 mL PPO提取液 处理30 min ,测酶活,计算抑制率。抑制剂使用浓 度Vc分别为01000、01075、01150、01300、01600、 01900、21500、31500 gL - 1 , CA分 别 为01000、 01500、21500、51000、101000、201000 gL - 1 , OA 分 别 为01000、0625、11250、21500、31750、 51000、101000 gL - 1 , LC分别为01000、01125、 01250、01375、01500、01750、11000 gL - 1 。 11318 复合抑制剂对PPO活性的影响 在测定单一抑制剂抑制PPO活力的基础上, 以Vc、CA、OA、LC 4种抑制剂做4因素3水平的 正交试验。Vc因素(A)设A1为01900 gL - 1 , A2 为21500 gL - 1 , A3为31000 gL - 1 , CA因素(B) 设B1为21500 gL - 1 , B2为51000 gL - 1 , B3为 71500 gL - 1 , OA因素(C)设C1为21500 gL - 1 , C2为31750 gL - 1 , C3为51000 gL - 1 , LC因素 (D)设D1为01500 gL - 1 , D2为01750 gL - 1 , D3 为11000 gL - 1 。测定酶活活力,并计算抑制率, 选出抑制效果最优的试剂组合。 2 结果与分析 211 PPO提取参数的确定 21111 液料比 以不同液料比提取PPO后,室温下测酶活, 结果如图1所示。当液料比是115 mLg - 1时 ,提取 的PPO活 性 最 大。当 液 料 比 小 于 或 大 于115 mLg - 1时 , PPO的活性都明显地降低。因此,选择 115 mLg - 1作为富士苹果 PPO提取的最佳液料比。 减少提取液使用量酶活降低是由于PPO不能完全 溶解出来;提取比例高于115 mLg - 1也不能引起酶 活升高,可能是由于较高的液料比会增加均质和酶 溶解难度,同时PPO的浓度也会降低。因此,选 择料液比115 mLg - 1为宜。 图1 液料比对PPO提取效果的影响 21112 pH值 不同pH值提取的PPO活性如图2所示。由于 酚类底物在高pH值下易发生自动氧化引起非酶褐 变,因此提取液的pH值只试验到718。 图2 pH值对PPO提取效果的影响 由图2可知,不同pH值的缓冲液提取的PPO 活性有2个峰,即pH值514和714时。这可能是 因为苹果中的同工酶所致,苹果的PPO主要存在 于叶绿体和线粒体中,叶绿体中的PPO适合在偏 酸性条件下提取,而线粒体中的PPO适合在偏碱 性条件下提取。由整个曲线可以看出pH值514时 提取的PPO活力要明显比pH值714时大,可知本 试验提取的PPO主要源于叶绿体,有少量源于线 粒体。 212 温度对PPO活性的影响 不同温度对PPO活性影响如图3所示。在5 790 2009年第4期 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 30 时, PPO活性随温度的升高而逐渐增大, 30 下PPO的活力较5 增加了57184 %;在30 60 时, PPO的活性逐渐降低,当温度上升至 60 时PPO活性较30下降了50147 %。这是因 为低温使PPO活性被抑制;而高温引起蛋白质变 性,使酶失活。从整个曲线来看, 2035时, PPO的活力较高, 30时活力最高。可见,富士 苹果PPO的最适温度为30。 图3 温度对PPO活性的影响 213 pH值对PPO活性的影响 如图4所示。PPO活性对pH值的变化较为敏 感, pH值215410时酶活迅速上升, pH值在410 时的PPO活力较pH值215时增加了44164 % ,相 当于每增加1个pH值, PPO活力就升高29176 %; pH值410715时酶活急剧下降;在pH值315 415时,富士苹果PPO活性较高,而在pH值410 时其活性最高。由此可见PPO活力在高酸性或偏 碱性条件下明显降低。这是因为PPO是一种含铜 蛋白酶,在高酸条件下,铜离子会以离子的形式解 离出来,从而使酶活降低。而在相对偏碱性的条件 下, PPO活性也会受到抑制。有研究报道香蕉PPO 的最适pH值为516 4 ,澳洲青苹PPO的最适pH值 为615 5 ,菊芋PPO最适pH值为711 6 ,可见PPO 随其原料来源、品种等的不同,其最适pH值也不 同;通过改变pH值可以抑制PPO的活性。 图4 pH值对PPO活性的影响 214 抑制剂对PPO活性的影响 21411 Vc 不同浓度的Vc对PPO活性影响如图5所示。 由图5可知,当Vc的添加量在01075 gL - 1 时, PPO的活性就已经受到抑制,抑制率达49187 %; 当添加量为21500 gL - 1 时,抑制率达到93138 % , 当添 加 量 达 到31500 gL - 1 时,抑 制 率 达 到 94116 %。由整个曲线可以看出,当Vc的添加量达 到01900 gL - 1 以上,曲线逐渐变得平稳,即再继 续增加Vc浓度,对酶活的抑制作用变化不大。可 见Vc对PPO活性表现出明显的抑制作用,并且这 种抑制作用随Vc浓度的提高而加强。但是当Vc增 加到一定的浓度时,其抑制能力变化不大。因此, 从经济角度考虑,我们可以选择Vc添加量为21500 gL - 1 ,就可以达到较好的抑制效果。Vc对PPO活 性的抑制作用是因为Vc作为PPO的辅基铜离子的 鳌合剂与铜离子键联,使PPO失活;其次,它还 作为醌类物质的还原剂,阻止醌类物质进一步自发 聚合形成褐色物质 7 。 图5 Vc对PPO活性的影响 21412 CA 图6 CA对PPO活性的影响 如图6所示。随CA添加量的增加PPO活性逐 渐降低,当CA添加量在51000 gL - 1时 ,抑制率达 53138 % ,而随其添加量的增加, PPO的活性降低 趋势不明显,故选择51000 gL - 1的 CA来抑制PPO 活性。CA不仅可以作为酸化剂,改变环境的pH 宋莲军,等:富士苹果多酚氧化酶的提取及特性的研究791 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 来抑制酶活,它还是一种鳌合剂,通过螯合PPO 的活性部位铜离子而抑制PPO的活力 8 。 21413 OA 不同浓度的OA对PPO活性影响如图7所示, 随OA添加量的增加PPO的活性逐渐降低,当OA 添加量在31750 gL - 1时 ,抑制率达60100 % ,当添 加量在51000 gL - 1时 ,抑制率达64191 % ,当添加 量在101000 gL - 1时 ,抑制率达65160 %。可见OA 可以部分抑制PPO活力。其抑制机理与CA相 似 9 。选择51000 gL - 1 作为OA抑制PPO活性的 浓度。 图7 OA对PPO活性的影响 21414 LC 不同浓度LC对PPO活性的影响如图8所示。 如图8所示,随LC添加量的增加PPO活性逐渐降 低,当LC添加量在01500 gL - 1时 , PPO的活性明 显降低,抑制率达到92105 % ,而随其添加量的增 加, PPO的活性降低趋于平缓,当添加量为01750 gL - 1时 ,抑制率达到94110 % ,当添加量为11000 gL - 1时 ,抑制率达到94132 % ,因此,选择LC添 加量为01750 gL - 1 ,作为抑制PPO活性的浓度。 目前LC的抑制机理尚有争议。早期学者认为LC 的SH基与PPO活性中心的铜配位而抑制其活 性 10 ;后来有报道认为酶促反应产生的醌直接与 LC结合形成无色化合物 11 ;还有学者认为这2种 机制并存 12 。因此,对于LC抑制PPO的机理有待 于进一步研究。 图8 LC对PPO活性的影响 21415 复合抑制剂 复合抑制剂对PPO活性影响如表1所示。在 所有正交处理中, 4号抑制效果最好,抑制率 96135 % ,其次是8号处理,抑制率达96100 %。通 过极差分析可知,复合抑制剂抑制率的主次因子分 别是LC、OA、CA、Vc ,而由单因素试验结果可知 Vc对PPO的抑制能力仅次于LC ,可见正交试验中 存在交互作用,由于交互作用的影响, Vc在复合 抑制剂中的作用较小。试验获得的复合抑制剂的最 优组合为A1B2C2D3,即Vc为01900 gL - 1 、CA为 51000 gL - 1 、OA为31750 gL - 1 、LC为11000 gL - 1 。经实验测得该复合抑制剂对PPO抑制率达 97183 %。 表1 复合抑制剂对PPO活性的影响 试验号组合抑制率% 1A1B1C1D147132 2A1B2C2D285193 3A1B3C3D395178 4A2B1C2D396135 5A2B2C3D147140 6A2B3C1D281165 7A3B1C3D282150 8A3B2C1D396100 9A3B3C2D147150 3 小结 富士苹果PPO的最佳提取条件为pH值514的 磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲液(含20 gL - 1 PVPP和 215 gL - 1 Triton X2100) ,液料比为115 mLg - 1 。 富士苹果PPO反应的最适温度为30,最适 pH值为410 ,因此可以通过改变PPO反应的温度 和pH值来抑制酶活。 Vc、OA、CA和LC均对富士苹果PPO的活性 起一定抑制作用,其中LC效果最好, Vc次之, OA和CA抑制能力较弱。11000 gL - 1 LC ,抑制率 达到94132 %; 31500 gL - 1 的Vc ,抑制率达到 94116 %; 101000 gL - 1 的OA ,抑制率达65160 %; 51000 gL - 1的 CA ,抑制率达53138 %。 Vc 01900 gL - 1 、CA 51000 gL - 1 、OA 31750 gL - 1 、LC 11000 gL - 1组合而得的复合抑制剂对富 士苹果PPO的抑制作用最好,抑制率达97183 %。 792 2009年第4期 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 参考文献: 1 NicolasJ J , Richard2Forget F C, G oupy P M, et al. Enzymatic browning reactions in apple and apple products J . Crit Rev Food Sci Nutr , 1994 , 34 (2) : 109 - 157. 2 Rocha AM,PilarCanoM,GaleazziM AM,etal. Characterisation ofstarkingapple polyphenoloxidase J . J Sci Food Aagric , 1998 , 77 (4) : 527 - 534. 3 王雪静,张子德,陈志周,等.桃果实中影响多酚氧化酶活 性因素的研究J .河北农业大学学报, 2005 , 28 (3) : 60 - 62. 4 张勇,池建伟,温其标,等.香蕉多酚氧化酶褐变性质的研 究J .食品与发酵工业, 2004 (5) : 53 - 57. 5 李佩艳,侯玉泽,李松彪,等.澳洲青苹多酚氧化酶特性的 研究J .河南农业科学, 2006 (9) : 93 - 96. 6 胡建锋,邱树毅,胡秀沂,等.菊芋多酚氧化酶的酶学特性 研究J .食品科技, 2007 (9) : 22 - 25. 7 Valentines M C, Vilaplana R , T orres R , et al. Specific roles of enzymatic browning and lignification in apple disease resistance J . Postharvest Biology and Technology , 2005 , 36: 227 - 234. 8 张孔海,孙万慧,段洪斌.果蔬食品的褐变与控制J .农 产品加工, 2005 (2) : 40 - 41. 9 Y ourk R , Marshall M R. A survey on the potential mode of inhibition for oxalic acid on polyphenol oxidase J . 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