冬凌草提取物脱色除杂方法的研究.pdf

第 25卷第 3期 2005年 9月 林? 产? 化? 学? 与? 工? 业 Chem istry and Industry of Forest Products Vo.l 25No . 3 Sept . 2005 冬凌草提取物脱色除杂方法的研究 * YUAN K? ? 袁 珂 1, 杨中汉2 ( 1. 浙江林学院 食品与药学院, 浙江 临安 311300; 2. 焦作大学 生化与环境工程系, 河南 焦作 454001) 摘? 要: ? 在进行冬凌草规模化提取研究中, 提取冬凌草甲素的同时还会夹杂大量色素及油脂 类杂质, 严重干扰冬凌草甲素的分离纯化。作者对脱色除杂方法进行了系统研究。采用大孔 吸附树脂吸附、 石油醚萃取、 醇提水沉、 活性炭回流、 活性炭超声波 5种方法进行研究与比较, 确定出最佳脱色除杂方法为活性炭超声波。通过正交试验, 确定出活性炭超声波的最佳工艺为: 用占药材干 重 5% 活性炭超声波提取 2次, 每次 20m in。 关键词: ? 冬凌草; 甲素; 活性炭; 超声波提取 中图分类号: TQ91 ; Q949. 777. 6? ? ? 文献标识码: A? ? ? 文章编号: 0253- 2417( 2005)03- 0025- 04 STUDY ON DECOLORIZATION AND I MPURITY? ELI M INATION OF EXTRACTS OF RABDOSIA REBESCENS YUAN Ke 1, YANG Zhong?han2 ( 1. College of Food and Phar mecy, Zhejiang Forestry University, Lin?an 311300 , China; 2. Depart ment of Bioche m istry oridonin; activated carbon; ultrasonic treatment 冬凌草 (Rabdosia rebescens ( Hems.l )H ara)系唇形科香茶菜属多年生草本植物的干燥地上部分, 主 产于我国江西、 江苏、 安徽、 河南等地, 其抗癌活性成分主要为二萜化合物冬凌草甲素。对冬凌草甲素进 行规模化提取具有良好的市场空间及开发应用前景。作者在对冬凌草提取物进行规模化生产工艺研究 中, 针对提取液中的大量色素及油脂, 采用不同的脱色除杂方法进行研究与方法比较。 1? 实验部分 1 . 1? 样品溶液的制备及测试方法 1 . 1 . 1? 材料、 仪器与试剂? 冬凌草全草购自河南省济源市药材公司。冬凌草甲素对照品: 自制, 含量 99. 22 % 。 Agilent 1100型高效液相色谱仪, 美国惠普公司; 自动进样器; HP1100化学工作站; TP300超声波提 * 收稿日期: 2004- 08- 20 ?作者简介: 袁 珂 ( 1959- ), 女, 北京人, 教授, 硕士生导师, 主要从事天然产物研究与新药开发; E?mail : Yuan_ke tom. com。 26? ? ?林? 产? 化? 学? 与? 工? 业第 25卷 取器, 北京天鹏电子新技术有限公司; R201B旋转蒸发仪, 上海申胜生物技术有限公司; 真空薄膜浓缩装 置, 自制; CS501型超级恒温水浴, 上海实验电器厂; 微量分析天平, EETTLER AE 240瑞士; 玻璃层析柱 及渗漉柱: ? 8 cm 150 cm; Diaion HP- 20大孔吸附树脂, 日本三菱公司; 甲醇, 色谱纯, 水, 双蒸水; 其它 试剂均为分析纯。 1 . 1 . 2? 色谱条件 ? 色谱柱为 C18柱, 流动相: 甲醇-水 (体积比 55! 45), 柱温 25 , 检测波长 ? 242 nm。 1 . 1 . 3? 对照品溶液的配制及标准曲线? 精密称取冬凌草甲素对照品 10 . 00mg, 加甲醇定容至 25mL量 瓶中, 摇匀, 得浓度为 400 g /mL的对照品溶液。 分别进样上述浓度为 400 g /mL的冬凌草甲素对照品溶液 0 . 2、 0 . 4 、 1 . 0 、 2 . 0 、 3 . 0、 4 . 0 、 5 . 0 、 6 . 0 、 7 . 0 、 8 . 0 L, 记录峰面积。结果冬凌草甲素进样量在 0 . 08 1 . 32 g之间, 峰面积与冬凌草甲素进样量 呈良好线性关系, 回归方程 Y= 1 464 . 41036X + 30 . 61838, r= 0. 999 97 。 1 . 1 . 4? 冬凌草提取液的制备及测定 ? 分别量取含醇量 50%的冬凌草浓缩液 8份, 每份 100mL, 按正交 试验表中所选取的因素水平进行脱色。抽滤, 除去活性炭后将脱色液分别减压浓缩至干, 然后用甲醇转 移至 100mL量瓶中用甲醇定容至刻度。用移液管吸取 1mL 样品溶液用甲醇定容至 100mL量瓶中。 测定时分别吸取 10 L进样, 记录峰面积, 计算冬凌草甲素的含量。 1 . 2? 脱色除杂方法的选择 对于冬凌草中有效成分的提取, 根据所提有效成分的性质及以往对冬凌草的研究经验, 并考虑到规 模化生产的实际, 常采用 95% (体积分数, 下同 )乙醇为溶剂进行渗漉提取 1, 将渗漉液真空薄膜浓 缩 2至原体积的 1/10 , 保持浓缩液中乙醇含量约 50%。此时浓缩液中含有大量脂溶性色素、 油脂等杂 质, 若继续浓缩将会结成黑绿色粘块, 无法进行后续分离纯化, 必须采用一定的方法除去。脱色除杂的 方法一般有以下几种, 作者分别进行了实验。 1 . 2 . 1? 大孔吸附树脂吸附法 ? 将 DiaionHP- 20大孔吸附树脂加水后先装柱, 然后进行前处理, 用水与 乙醇交替洗脱 3次, 最后再用 50 % 乙醇洗脱。将含醇量 50% 的冬凌草浓缩液 4 000mL (折合生药 5 kg)上柱, 依次用 3倍于柱体积的 50%、 60% 、 80% 和 95% 乙醇, 以 10mL /m in的流速进行梯度洗 脱, 收集各部分洗脱液, 洗脱液分别真空浓缩成干燥粉末, 得到各有效成分。而色素则被树脂牢固吸附, 此时需用 70%丙酮将色素全部洗脱下来。然后用稀酸、 稀碱及水处理使树脂再生。利用此法虽能达到 脱色除杂目的, 但工艺较复杂, 操作麻烦, 同时存在费时、 费工、 费溶剂等缺点。 1 . 2 . 2? 石油醚萃取法 ? 利用石油醚萃取需在两相中分配, 这就需要将含醇量为 50%的冬凌草浓缩液 继续减压浓缩至不含醇的水溶液, 此时会有大量色素、 油脂结成粘块, 萃取起来十分不便。并且当每次 用 2倍量石油醚萃取 6次后, 经对水溶液进行 TLC检测及通过色泽观察, 发现仍不能将色素除干净, 且 大量萃取液需减压回收。此法仍存在费时、 费溶剂和费能源的不足。因此, 只为脱色除杂而选用石油醚 萃取, 此法不可取。 1 . 2 . 3? 醇提水沉法? 将冬凌草浓缩液加等量水, 搅拌后低温放置, 也可将色素、 油脂类沉淀除去。但由 于冬凌草中的有效成分为脂溶性成分, 在水中几乎不溶, 采用此法在除去色素的同时, 冬凌草甲素也会 随色素一起被除去, 故此法不可采用, 它只适用于提取水溶性成分时来沉淀色素 3。 1 . 2 . 4? 活性炭回流法 ? 活性炭脱色是除去脂溶性色素常用的方法之一。根据文献报道及作者过去对 冬凌草的研究经验, 冬凌草提取后的浓缩液均采用活性炭回流脱色后再进一步分离纯化 4 5, 一般方法 为每次加药材干质量 5%的活性炭在 90 水浴中回流脱色 2次, 每次 40m in , 抽滤。除去活性炭后得 到的浓缩液经 TLC检测及色泽观察, 基本将色素除净。但由于此法使药液在较高温度下加热, 冬凌草 甲素受热后破坏较严重。若在常温下浸泡或 60 浸泡脱色需要很长时间, 且脱色效果也不佳。 1 . 2 . 5? 活性炭超声波法? 考虑到冬凌草甲素为热敏性成分, 因此作者尝试通过加活性炭超声波的方 法, 利用超声波产生的强烈的空化效应、 机械振动、 高的加速度起到乳化、 扩散、 击碎和搅拌作用, 增大物 质分子运动频率和速度、 增加溶剂穿透力 6 7, 从而使活性炭与药液充分接触, 以达到快速脱色的目的。 超声波脱色能在不加热的情况下, 短时间内将色素完全脱去。虽然机械振动等作用也能产生热能, 第 3期袁 珂, 等: 冬凌草提取物脱色除杂方法的研究27? ? ? 但在短时间内温度仅能达到 40 50 , 在此温度下短时间受热, 对冬凌草甲素的影响较小。 为了确定超声波脱色的最佳条件, 并与回流脱色法相比较, 以确定两法的优劣, 作者采用正交试验 法对超声波法脱色与回流法脱色的脱色条件进行优选。 2? 结果与讨论 2 . 1? 活性炭回流及活性炭超声波除杂的工艺条件确定 通过正交试验, 以冬凌草甲素的含量与脱色液色泽为考察指标, 选择对脱色效果影响较大的活性炭 用量、 脱色次数及脱色时间 3个因素, 每个因素设 2个水平, 选用 L4( 2 3 )正交表, 对两种脱色方法进行 了正交设计。正交试验的两个评价指标, 采用权重系数分别为 0 . 6和 0 . 4的综合评分进行数据分析, 结 果见表 1 2 。 表 1? 活性炭回流法正交试验设计及试验数据 Table 1? The results of orthogonal test on refluxing method 试验号 testNo. A 活性炭用量 /% dosage of activated carbon B 脱色次数 /次 decoloration ti mes C 脱色时间 /m in decoloration ti me 冬凌草甲素含量 /( mg #mL- 1) oridonin content 色泽排序 (差?好 ) sequence of product color ( bad? good) 综合评分 comprehensive grading 131306. 23456170. 00000 232405. 43427382. 29819 351406. 17254279. 40313 452305. 67217495. 58769 冬凌草甲素含量 oridonin content Ij 11. 6688312 . 4071011 . 90673 IIj 11. 8447111 . 1064411 . 60681 R0. 087940 . 650330 . 14996 色泽 color Ij 435 IIj 675 R120 综合加权评分 comprehensive weighed grading Ij 152. 29819149 . 40313165. 58769 IIj 174. 99082177 . 88588161. 70132 R22 . 6926328 . 482751. 94319 表 2? 活性炭超声波法正交试验设计及试验数据 Table 2? The results of orthogonal test on ultrasonic treatmentmethod 试验号 testNo. A? 活性炭用量 /% dosage of activated carbon B? 脱色次数 /次 decoloration ti mes C? 脱色时间 /m in decoloration ti me 冬凌草甲素含量 /( mg #mL- 1) oridonin content 色泽排序 (差?好 ) sequence of product color ( bad? good) 综合评分 comprehensive grading 131206. 72397170. 00000 232306. 31745386. 37250 351306. 68374279. 64102 452206. 39312499. 04773 冬凌草甲素含量 content of oridonin Ij 13. 0414213 . 4077113 . 11709 IIj 13. 0768612 . 7105713 . 00119 R0 . 017720 . 348570 . 05795 色泽 color Ij 435 IIj 675 R120 综合加权评分 comprehensive weighed grading Ij156. 37250149 . 64102169. 04773 IIj178. 68875185 . 42023161. 01352 R22 . 3162512 . 88961. 51711 由表 1可以看出, 活性炭回流脱色的 3因素主次顺序为 B A C, 最佳组合为 B2A2C1, 即用 5% 活 性炭回流脱色 2次, 每次 40m in ; 由表 2看出, 加活性炭超声波脱色的 3因素主次顺序为 A B C, 最佳 28? ? ?林? 产? 化? 学? 与? 工? 业第 25卷 组合为 A2B2C1, 即用 5% 活性炭超声波脱色 2次, 每次 20m in。 2 . 2? 两种脱色除杂方法的比较 按照优选出的最佳工艺条件, 以脱色前后冬凌草甲素的含量变化为参考, 浓缩液量 1 000mL, 活性 炭用量 10% , 脱色次数为 2次, 分别进行回流脱色与超声波脱色实验, 结果见表 3 。 表 3? 两种脱色方法对冬凌草甲素含量的影响 Table 3?Effects of twomethods of decoloration and i mpurity?eli m ination on oridonin content 脱色方法 decolorization methods 受热温度 / temperature 脱色时间 /min ti me 甲素含量 oridonin content /(mg #mL- 1) 脱色前 before decolorization 脱色后 after decolorization 损失率 /% loss rate 脱色后药液颜色 color after decolorization 回流脱色 reflux90807 . 123165. 6721720 . 4棕红 brown red 超声波脱色 ultrasonic40 50407 . 123166. 3931210 . 25橙红 orange red 2 . 3? 脱色除杂最佳工艺条件的确定 最佳工艺条件是用 5% 活性炭超声波脱色 2次, 每次 20m in 。具体操作为: 称取 5 kg冬凌草全草, 打成粗粉后用 95% 的乙醇湿润 4h后装入渗漉柱中, 用 95% 乙醇浸泡 12 h后, 按正交试验优选的渗漉 条件进行渗漉, 收集渗漉液。将提取液采用连续式真空薄膜浓缩装置浓缩至原体积的 1/10 。每次加入 折合药材干质量 5%的活性炭置超声波提取器中超声波脱色两次, 每次 20m in 。抽滤, 除去活性炭后即 得到脱色除杂后的橙红色冬凌草浓缩液。 2 . 4? 讨论 在以往对冬凌草及其制剂的研究中, 从原料到成品, 往往存在冬凌草甲素的转移率偏低问题。由于 冬凌草甲素为热敏性成分, 结构极不稳定, 受热后容易分解变化。因此在对冬凌草及其制剂的多步骤研 究中, 尽管尽量采用常温或低温操作, 把损失降低到最低限度, 但在进行跟踪检测时发现, 损失最大的一 步即用活性炭回流脱色。当然活性炭本身对有效成分也有一定的吸附作用, 但实验发现, 吸附量很小。 改用超声波法脱色后, 由于避免了高温长时间加热, 最大限度地保护了冬凌草中的热敏性成分不受破 坏, 冬凌草甲素的损失率比回流法脱色降低了一半, 大大提高了冬凌草甲