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FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2009 年 第 34 卷 第 11 期 葡萄籽提取物中原花青素的 纯化及其检测 Purification and detection of the proanthocyanidins from the grape seed extracts ZHAO Ping, ZHANG Zhi-jun, ZHANG Yue-ping (College of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018) 赵平， 张志军， 张月萍 (河北科技大学化学与制药工程学院，石家庄 050018) 摘要： 以葡萄籽提取物为原料，研究用 AB-8 型大孔吸附树脂对原花青素分级纯化，建立了高效 液相色谱(HPLC)方法，用此方法对葡萄籽提取物中原花青素定性、对低聚体(OPC)定量分析。为 得到聚合度不同的原花青素，实验选择 20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇对原花青素进行梯度洗 脱，洗脱液经真空干燥得原花青素固体，即洗脱液成品。HPLC 分析结果显示：20%乙醇洗脱液 中的原花青素是单体和 OPC，OPC 含量为 17.42%；40%乙醇洗脱液中的原花青素是 OPC 和高聚 体(OPC)，OPC 含量为 80.32%；60%乙醇洗脱液中的原花青素是 PPC。 关键词： 原花青素；OPC；HPLC；梯度洗脱 中图分类号： R 284.2文献标志码： A文章编号： 1005-9989(2009)11-0179-05 收稿日期： 2009-03-16 作者简介： 赵平(1965)，男，博士，教授，研究方向为化工分离及生物分离。 取工艺上的应用J.食品科学,1997,18(7):22-26 7李祖光,高云芳,刘文涵.黑胡椒风味成分的研究J.食品 科学,2003,24(10):128-131 8郑品梅,邹纲明,李彦威.胡椒油的研究进展J.食品科技, 2007,(1):25-28 9Mauricio A, Rostagno, Miguel Palma, et al. Microwave assisted extraction of soy isoflavonesJ. Analytica Chimica Acta,2007,588(2):274-282 10Marie E Lucchesi, Farid Chemat, Jacqueline Smadja. Sol vent-free microwave extraction of essential oil from aro matic herbs: comparison with conventional hydro- distilla tion J. Journal of Chromatography A,2004,1043 (2):323- 327 11刘文,孙宗章.胡椒中胡椒碱的提取工艺研究J.中国中 药杂志,2003,28(5):456-457 12康业斌,商鸿生.溶剂法提取丹皮酚的工艺优化J.农业 工程学报,2006,22(10):240-242 13郭锦棠,李伶,杨俊红,等.微波提取山楂中总酮的正交实 验研究J.中国中药杂志,2005,40(2):112-115 14黄瑞华,韩伟,周永传,等.微波辅助提取淫羊藿苷的中试 研究J.中成药,2004,26(7):525-528 15张沛玲.紫外分光光度法测定胡椒碱J.中国卫生检验 杂志,2001,11(6):693 16GB/T 17528-998 胡椒碱含量的测定分光光度法S ! 提取物与应用 179 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2009 年 第 34 卷 第 11 期 原花青素(Procyanidins，简称 PC)是植物王国 中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，由不同 数量的 (+)- 儿茶素 (+)- Catechin)和表儿茶素(- ) - Epicatechin)1单体缩合而成的聚合物2，还含有少 量的儿茶素、表儿茶素和咖啡酸等有机酸3。最简 单的 PC 是儿茶素或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素 形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至 十聚体。按聚合度的大小，通常将二至四聚体称 为低聚体(Procyanidolic Oligomers，简称 OPC)，五 聚体以上称为高聚体(Procyanidolic Polymers，简称 PPC)。根据聚合度、单体形式、连接键的不同以及 是否会与糖、蛋白质结合可以形成各种不同类型 的原花青素4。因此，葡萄籽提取物中的原花青素 具有复杂的结构和数量，其二聚体可能的结构就 达到了 162 种，三聚体可能的结构达到了 550 种， 四聚体可能的结构就达到了 1200 种5。因此，从 葡萄籽提取物中分离获取每个 OPC 并对其进行定 量分析是非常困难的一件事情。本文结合葡萄籽 提取物的实际情况，并参照天津尖峰最新的检测 分析方法，建立了用 HPLC 方法对原花青素定性、 对 OPC定量的检测方法。 OPC 拥有强有力的抗氧化、清除自由基能力 和对人体微循环特殊改善的双重功效，以高效、 低毒、高生物利用率而著称。葡萄籽提取物中 OPC 含量较低，本文以葡萄籽提取物为原料，选 用大孔吸附树脂对自制的原花青素进一步吸附、 洗脱分离，进行纯化，就纯化后的原花青素产品 用 HPLC 方法进行分析，探索提取高纯度 OPC 的 方法，为进一步开发利用原花青素提供参考。 1实验材料 1.1仪器 TU- 1810 型紫外分光光度计：北京普析通用 仪器有限公司；DK- 98- 1 型电热恒温水浴锅：天 津市泰斯特仪器有限公司；RE- 52A 型旋转蒸发 器：上海市亚荣生化仪器厂；DZ- 2BC 型真空干燥 箱：天津市泰斯特仪器有限公司；Lab Workstation 2006 型高效液相色谱仪：北京莱伯泰科仪器有限 公司；SinoChromODS- BP 型色谱柱：大连依利特。 1.2试剂 原花青素标准品：天津尖峰天然产物研究开 发公司，纯度95%；乙腈：中国医药集团上海化 学试剂公司，HPLC 级；乙酸：广东汕头市西陇化 工厂，分析纯；超纯水：Millipore 公司；甲醇、硫 酸、盐酸均为分析纯；实验用水为去离子水。 2实验方法 以葡萄籽提取物为原料，采用经预处理的 AB- 8 型大孔树脂吸附纯化6，以不同浓度的乙 醇进行梯度洗脱，洗脱液经真空干燥得原花青素 固体；采用 HPLC 法对分级产物进行定性、定量 分析。 2.1HPLC 方法的建立 2.1.1 液相色谱条件 流动相：A 为 2%冰醋酸；B 表 1高效液相色谱梯度程序 时间/min流动相 A/%流动相 B/% 01000 31000 6964 159010 308515 507723 607525 667030 805050 832080 851000 1051000 Abstract:Extractsfromgrapeseedarechosenasrawmaterialstostudygradepurificationof proanthocyanidins with AB-8 macro porous adsorption resin, and HPLC method was set up, with which grape seed proanthocyanidin extract is qualitative analysed and the OPC is quantitative analysed. To get a different degree of polymerization of proanthocyanidins, 20%, 40%, 60% ethanol are selected to gradient eluting the proanthocyanidins in this study, and roanthocyanidin in a solid state can get from eluate through vacuum drying, that is the eluate ultimated product. It is indicated from the result of HPLC analysis that: the monomer and OPC are in 20% ethanol eluate, and OPC accouts for 17.42%; the OPC and PPC are in 40% ethanol eluate, OPC is 80.32%; in 60% ethanol eluate, PPC is existed only. Key words:proanthocyanidins; OPC; HPLC; gradient elute 提取物与应用 180 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2009 年 第 34 卷 第 11 期 为乙腈水冰醋酸(8019.60.4)； 检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；色谱 柱：反相 C18柱；梯度程序见下表 1。 2.1.2 对照品测定 精密称取原花青素标准品约 50 mg，置 10 mL 棕色容量瓶中，加入 50%乙醇，超 声溶解放冷至室温，定容，摇匀，配制成原花青 素 5 mg/mL 的对照品溶液。过 0.45 m 滤膜，10 L进样进行 HPLC分析。 2.2样品制备 将预处理好的 AB- 8 型大孔吸附树脂装入色谱 柱中，将已知浓度原花青素样品溶液以适宜的流 速加入色谱柱，分批收集流出液，并采用香草醛 - 硫酸法7测定其浓度。待流出液浓度达到样品液浓 度 1/10 时，停止加样，用 4 倍柱床体积(BV) 的去离子水以 2 BV/h 的流速洗柱子；洗完后依次 用体积分数为 20%、30%、40%、50%、60%的乙 醇对原花青素进行梯度洗脱，洗脱流速 2 BV/h， 各 4 BV，分批收集各流出液，进行真空干燥得到 不同浓度乙醇洗脱条件下的成品。 2.3样品检测及含量测定 2.3.1 样品检测 精密称取不同浓度乙醇洗脱条件 下(20%、30%、40%、50%、60%)的成品各约 50 mg置 10 mL棕色容量瓶中，加入 50%乙醇，超 声溶解放冷至室温，定容，摇匀，过 0.45 m 滤 膜，10 L进样进行 HPLC分析，通过原花青素标 准谱图判断不同浓度乙醇洗脱液中低聚体、高聚 体的存在状况。 2.3.2 含量测定结合原花青素标准谱图和 HPLC 分析结果，对不同浓度乙醇洗脱液中 OPC 进行含 量测定。 3结果与讨论 3.1HPLC 分析方法的建立 原花青素是具有不同聚合度的一类多酚物质， 聚合度不同，分子极性不同，在 C18色谱柱上吸附 的牢易程度就不同，用流动相进行洗脱的时候出 峰的时间则有所差异。不同聚合度原花青素的保 留时间是不一样的，而且聚合度低的 OPC 的保留 时间明显比聚合度高的 PPC 的保留时间要少。假 定葡萄籽提取物中所有的物质在进行 HPLC 分析的 时候都有出峰，通过对保留时间在某一特定时间 段内物质的峰进行定性、定量分析，可以得出 HPLC分析结果。 图 1 为天津尖峰天然产物开发公司提供的的 原花青素标准品 HPLC图谱，图 2 为实验采用尖峰 公司提供的原花青素标准品进行 HPLC 分析得出 的 HPLC 图谱。图 2 和图 1 对比发现，实验采用 的原花青素标准品 HPLC 分析图谱的保留时间和 峰高较尖峰公司提供的原花青素标准品 HPLC 图 谱有稍微差别，这是由于实验室条件和尖峰公司 实验室条件的差异造成的，但可以确定出单体(没 食子酸 + 儿茶素 + 表儿茶素)和 B2 的保留时间。 从 HPLC图谱可以看出，原花青素标准品中物 质的成分非常复杂，对 OPC 和 PPC 的定性和对 OPC 定量不可能把其中的每一个成分分离出来进 行分析，因此，只能选定某一时间段出峰的物质 为 OPC 和 PPC 成分进行分析。实验采用尖峰公司 提供的质谱分析数据，选定从没食子酸峰出现至 67 min 内 出峰的物质 为 单 体 和 OPC 的 物 质 ， 67100 min 内出峰的物质为 PPC 的物质。从 HPLC 图谱可以看出 OPC 和 PPC 的保留时间存在明显的 差异，因此从没食子酸峰出现至 67 min 内出峰的 物质为单体和 OPC 的物质是切实可行的。通过计 算保留时间在从没食子酸峰出现到 67 min 所有物 质的峰面积之和为单体和 OPC 物质的峰面积，由 OPC 和单体的峰面积占整个峰面积的百分比减出 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 时间/min 没食子酸 B2 表儿茶素 图 1天津尖峰原花青素标准品 HPLC 色谱图 儿茶素 020406080100 160 140 120 100 80 60 40 20 0 mAU 儿茶素 没食子酸 表儿茶素 B2 图 2实验原花青素标准品 HPLC 色谱图 时间/min 提取物与应用 181 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2009 年 第 34 卷 第 11 期 表 2不同浓度乙醇洗脱液成品的 HPLC 分析结果 不同浓度乙醇 洗脱液/% 2030405060 HPLC 定性分析 结果 单体和 OPC 单体和 OPC OPC 和 PPC PPCPPC HPLC 定量分析结 果(OPC 含量/%) 17.4282.5878.2300 洗脱液成品数量/ mg 73.58 105.56365.78325.63 125.36 020406080100 80 60 40 20 0 mAU 图 540%乙醇原花青素洗脱液 HPLC 色谱图 时间/min 020406080100 40 20 0 mAU 图 650%乙醇原花青素洗脱液 HPLC 色谱图 时间/min 020406080100 40 20 0 mAU 图 760%乙醇原花青素洗脱液 HPLC 色谱图 时间/min 120 100 80 60 40 20 0 020406080100 儿茶素 B2 表 儿茶素 mAU 图 430 %乙醇原花青素洗脱液 HPLC 色谱图 时间/min 图 320%乙醇原花青素洗脱液 HPLC 色谱图 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 儿茶素 没食子酸 020406080100 mAU 时间/min 单体的含量来表示 OPC的含量。即： 总峰面积：从没食子酸峰出现至 100 min 内的 全部峰面积。 单体峰面积和 = (没食子酸 +儿茶素 +表儿茶素) 峰面积和 单体(%)单体峰面积和 / 总峰面积 低聚体(%)(从没食子酸峰出现至 67 min 峰面 积和单体峰面积和)/ 总峰面?积(1) 采用此方法的色谱分析条件，可以使葡萄籽提 取物中不同聚合度的原花青素得到很好的分离。但 是由于高聚原花青素分子与 C- 18 柱吸附得非常牢 固，因此必须采用极性小的溶剂进行洗脱，而且要 求整个洗脱的时间比较长，在实验建立的这个方法 中，洗脱运行时间达到了 100 min 才能把色谱柱上 所吸附的物质完全洗脱下来。 3.2不同浓度乙醇洗脱液成品的 HPLC 分析 结合图 2 和式 3- 1，对图 3 图 7 进行分析， 不同浓度乙醇原花青素洗脱液成品的 HPLC 定性、 定量分析结果如表 2 所示。 AB- 8 型树脂属于弱极性吸附剂，原花青素极 性越小，与树脂之间的吸附力越强。对于弱极性的 树脂，洗脱液极性越小，洗脱能力越强。从原花青 素的分子结构来看，随着聚合度(分子量)的增 加，分子极性降低，与树脂之间的吸附作用增强， 表现在解吸特性上则需要更高浓度的乙醇才能洗 脱，为得到聚合度不同的原花青素，采用不同浓度 的乙醇梯度洗脱。由于 40%乙醇较 30%乙醇的洗 脱能力强，60%乙醇较 50%乙醇的洗脱能力强，为 了减少洗脱次数可以省去 30%乙醇洗脱；同理可 以省去 50%乙醇洗脱。由以上分析，实验选择 20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇对原花青素进行梯 度洗脱。 提取物与应用 182 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2009 年 第 34 卷 第 11 期 020406080100 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 mAU 儿茶素 没食子酸 图 820%乙醇原花青素洗脱液的 HPLC 色谱图 时间/min 120 100 80 60 40 20 0 -20 020406080100 mAU 儿茶素 儿茶素B2 图 940%乙醇原花青素洗脱液的 HPLC 色谱图 时间/min 结合图 2 和式 1，分析图 8 图 10，20%乙醇、 40%乙醇、60%乙醇原花青素洗脱液成品的 HPLC 定性、定量分析结果如表 3 所示。 由表 3 可知，20%乙醇洗脱液成品中主要含有 原花青素单体，40%乙醇洗脱液已经含有部分 PPC，OPC 的含量达到 80.32%，且 40%乙醇洗脱 液已经洗脱全部的 OPC，而 60%乙醇洗脱液中基 本上是 PPC。因此，通过梯度洗脱已经达到不同聚 合度原花青素的分离。 4结论 HPLC 法基本能对葡萄籽提取物中的原花青素 进行定性、定量分析，可以为目前的葡萄籽提取物 厂家提供一种质量分析手段。在葡萄籽提取物中 OPC 含量高低成为产品质量的关键指标，而目前 在不可能逐个分离葡萄籽提取物中 OPC 的前提下， 采用此方法来评定其中的 OPC 含量不失为一种可 行的方法。 以 AB- 8 树脂为载体，研究原花青素的梯度洗 脱分级分离，HPLC 法分析表明，通过逐步提高乙 醇浓度可将原花青素按聚合度由低到高的顺序依次 洗脱，从 40%乙醇的洗脱液中可以得到 OPC 含量 相对较高的组分，但 40%的乙醇洗脱液中含有 PPC，需要进一步纯化来得到含量更高的 OPC，这 有待于进一步研究。 参考文献： 1Haseeb Nawaz, John Shi, Gauri Smittal, et al. Extraction of polyphenols from grape seeds and concentration by