酿酒酵母生物转化蛋氨酸生产S—腺苷—L—蛋氨酸.pdf

第 1 8卷第 4期 2 0 0 2年1 2月 化学 反应 工 程 与工艺 Ch e mi c a l Re a c t i o n En g i n e e r i n g a n d Te c h n o l o g y Vol 1 8，No 4 De c， 2 002 文章编 号 ：1 0 0 1 7 6 3 1 ( 2 0 0 2 ) 0 4 -O 3 l O O 5 酿 酒酵母 生物 转化 蛋氨酸 生产 S 一 腺 苷一 L 一 蛋氨酸 刘 惠 ， 林 建平 ， 吴 坚平 ， 岑 沛 霖 ( 浙 江 大学生 物 工程 与化 学 工程 学 系生 物工 程研 究所 ， 浙 江 杭 州 3 1 0 0 2 7 ) 摘 要 ： 摇瓶 考 察筛选酿 酒酵 母 ( z j u s 1 ) 培 养 l d后 补加 蛋 氨酸 和葡 萄糖 生产 S 一 腺苷一 L 一 蛋氨 酸 ( S AM ) ， 并考 察 了酵 母 提 取 物 补加 蛋 氨 酸 浓 度 、 葡 萄糖 浓 度 及转 化 p H 对 酵母 细胞 的生 长 和 S AM 产 量 的影 响 ， l 5 L B B r a u n 罐 间歇 培养 及转 化 过程 实 验表 明 ， 溶 氧提 高 利于 碳源 利 用 、 细胞 生 长和 S AM 产 量提 高 ， S AM 水平 可达 8 0 0 mg L， 酵母 密度 D =1 5 g L， 蛋氨酸 转化 率约 3 O 。 关键 词 ：s 一 腺苷一 L 一 蛋氨酸 ( Ad o Me t ， S A M ，S AM e ) ； 酿酒 酵母 ； 蛋 氨酸 ； 生物转 化 中 图分类 号 ：X1 7 2 文 献标 识码 ：A 1 前 言 S 一 腺苷一 L 一 蛋氨 酸 ( S a d e n o s y l I 一 me t h i o n i n e ，简称 Ad o Me t ， S AM 或 S AM e ) ， 一种 生物体 内广 泛存 在的小分子 ， 参 与体 内约 3 5种生 化反应 ， 对关节 病疗效显著 ， 还 是一 种有效 的抗抑郁 药 ， 利于各 种 肝 病 的 恢 复 n 。 胞 内 S AM 是 由 S AM 合成酶催 化 1分 子的蛋 氨酸和 1分子 的 ATP生成 的 ， 生产方法 主要有 酶 法 和微生物转化 法 ， 其 中利 用酵母在 富含 蛋氨酸前体 的基质 中进行生物转 化的方法采用最广 。 本研究将对 酵母进行筛选 ， 对 高产 S AM 菌株生 产能力及其生产条件进 行考察 。 2材 料 和 方 法 2 1菌 种 及 保 藏 毕赤 酵母 z j u p l 、 酿酒酵母 ( S a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a e ) z j u s 1及 z j u s 2由本 实验室 保藏 ， K 氏 白酒 酵母 和 8 5黄酒 酵母 由杭州微生物 研究所 提供 。菌种 保存在斜 面培养基 上 ， 4 | C储藏 ， 每 3个 月转接 1 次 。 2 2 培 养 基 质 组 成 和 培 养 条 件 2 2 1限碳培养基 种 子 培 养基 ( g L) ： 麦牙 汁 1 O ， 酵母 膏 3 ， 蛋 白胨 5 ， 葡 萄糖 1 0 ， 自来 水 配制 ， 加 热 溶解 后 分装 ， 1 2 1 C湿 热 灭 菌 1 5 2 0 mi n 。 摇瓶 培养 基 ( g I ) ： 葡萄糖 3 O ， 酵母 膏 3 ， ( NH ) S O 5 ， Kz HP O 3 Hz O 5 ， KH2 P O 1 0 ，Mn S O 7 H O 0 1 ， Z n S O 7 H O 0 1 ， Mg C 1 0 2 ， C a C1 0 1 ， 柠檬酸三钠 1 ， 加热溶解后分装 ， 1 2 1 C湿热灭菌 15 2 0 m i n。 收稿 日期 ： 2 0 0 2 0 4 0 8； 修 订 日期 ： 2 0 0 2 0 5 2 9 作者 简介 ： 刘惠 ( 1 9 7 5 一 ) 女 ， 博 士研究 生 ； 岑沛 霖 ( 1 9 4 5 一 ) ， 男 ， 教授 ， 博 导 ， 通讯联 系 人 。 赫 维普资讯 第 4期 刘 惠等 酿 酒 酵母 生物 转 化蛋 氨 酸生产 S 一 腺 苷一 L 一 蛋 氨酸 3 1 1 2 2 2 培 养 方 法 从新鲜斜 面接种一环酵母于 1 0 0 mL种子 培养基 中， 摇 床 ( 2 8 C， 1 8 o r mi n ) 培养 2 4 h 。从种子瓶 以 1 0 的接种 量接种 5 0 0 ml 摇瓶 ， 装 液量 5 0 mI ， 摇床 ( 2 8 C， 1 8 0 r mi n ) 培养 ， 另加 试剂 时另 作说 明 ， 或者从种子瓶 以 1 0 的接 种量接种 1 5 I B B r a u n罐 ， 培养基 同摇瓶 培养基 ， 控 温 2 8 C。另加试剂 时另作说 明 。 2 2 3转 化 方 法 酵母 摇瓶 或者 1 5 I 罐培养 1 d后补 加 Ad o Me t的前体 蛋氨酸 和葡 萄糖进行 转化 ， 即生产分培 养 和转 化 2阶段 进 行 。 2 3分 析 方 法 2 3 1 细 胞 干 重 ( D C ) 的测 定 菌液离 心获得菌体 ， 在 1 0 5 C下烘 干至恒重 ， 称重 。 2 3 2 S AM 的 定 量 分 析 离 心 ( 3 0 0 0 r mi n ) 获得 的酵母菌体使 用 1 5 mo l I 的高氯酸破碎 1 5 h后 ， 离心 ( 4 0 0 0 r mi n ) 收 集上 清 ， 适 当稀释后使用 HP I C分 析L 5 。 2 3 3 糖 浓 度 的 测 定 培 养 基 中所 含 的 葡 萄 糖 浓 度 ， 采 用 DNS法 测 定 。 2 3 4乙 醇 的 测 定 利用 1 0 2气 相色谱仪测定酒精浓度 。 操作条 件 ： 固定相 GDX一 1 0 4担体 ， 柱 3 mm4 0 0 0 mm， 测 定 方 法 为 热 导 电 流 法 ， 载 气 为 氢气 ， 载 气 流 量 3 0 mI mi n ， 柱 温 1 1 0 C。 2 3 5其他 p H 采用 P HS 一 9 V 型酸度计测定 。 发 酵罐 中的温度 、 溶氧 和 p H 由发酵罐 中相应的 电极在线测量 。 各种 比色法采用的分光光度计为 HP 8 4 5 2 A 型紫外 一可见光分光光 度计 ( HP C o mp a n y ， Ge r ma n y ) 。 3结 果 与讨 论 3 1摇 瓶 实 验 结 果 3 1 1几 种 酵 母 产 S AM 能 力 酵母摇 瓶培 养 2 4 h后 ， 补加 蛋氨 酸 ( 1 g I ) 和葡萄糖 ( 3 0 g L) ， 考 察 S AM 产 量 ， 结 果如下 表 1 。 以下 实验如无 特殊说 明 ， 采用 同样方 法进行 。 表 1 几 种酵 母 在蛋 氨 酸存在 时 S AM 产 量 Tabl e 1 SAM pr oduc t i vi t i e s of s e ve r a l ye a s t s i n p re s enc e of L- m e t hi o ni ne 可 见酿酒酵母 z j u s l 及 z j u s 2相 比其他 酵母具有明显 的积 累 S AM 的能力 ， 其 中尤 以酵母 z j u s l为 最 好 。 以后 的 工 作 将 针 对 该 酵 母 考 察 其 产 S AM 过 程 。 3 1 2 酵 母 提 取 物对 细胞 生 长 及 S AM 产 量 影 响 酵 母 培 养 过 程 中在 接 种 时期 加 入 酵母 提 取 物 酵母 先 培 养 2 4 h， 然 后 补 加 蛋 氨 酸 ( 1 g I ) 和 葡 萄 糖 ( 3 0 g I ) ， 酵母 提取物浓度 p Y x 对产量 的影 响见 图 1 。 维普资讯 3 1 2 化学 反应 工 程 与工 艺 2 0 0 2正 可见在培养过 程 中加入适量 的酵母 提取物是必要 的 ， 明显影 响细胞 干重和产物产量 ， 这是 因为酵 母 生长所 必需 的一些 氨基酸 和蛋 白质合成 较慢 ， 而酵母 提 取物可 以充分 提供 ， 从 而可 以促进 细胞 生 长 ， 影响 S AM 合成能力 而影响产量 。 3 1 3 补 加 葡 萄 糖 浓 度 对 S AM 产 量 影 响 b D 岛 图 1 酵 母 提 取 物 对 产 量 的 影 响 图 2补 加 葡 萄 糖 浓 度 对 产 物 转 化 的 影 响 F i g 1 E f f e c t s o f y e a s t e x t r a c t s o n t h e p r o d u c t i o n ( 蛋 氨酸浓 度 0 6 g L) Fi g 2 Ef f e c t o f Gl u c o s e c o n c e n t r a t i o n o n t h e p r o d u c t i o n wh e n me t h i o n i ne 0 6 g L wa s a d d e d 酵母培养 2 4 h后 补糖量对产量 的影 响如图 2所示 ， 补加 葡萄糖 量对酵母干 重和产物 的积 累影 响 显著 ， 干重 随补糖 浓度 p G持续增 加 ， 过高 葡萄糖 浓度会 降低 产物水平 ， 最适 葡萄糖浓度 约 3 0 g L。 3 1 4 蛋氨酸 浓度对 S AM 产量影响 补加蛋 氨酸量对 产量 的影 响见 图 3 ， 随着蛋 氨酸浓度增加 ， 胞 内 S AM 的含量几乎呈线性 增加 ， 但 当蛋氨酸浓度 P M超 过 0 8 g L时 ， S AM 的含量 将趋于稳定 ， 蛋氨酸转化 率 则随浓度增加 而降低 。 蛋 氨酸对干重 的影 响不大 ， 1 0 g I 以上不能继 续促进 S AM 产 量 的提 高 ， 而蛋 氨酸 的转化 率保持 在 1 5 4 O 。 3 1 5 p H 对 产 量 的影 响 由于采用培养及 转化两 阶段方 法生产 S AM ， 培养 2 4 h以后 由于酵母较强 的产酸 能力而使 p H值 一 般下降 明显 ， 用 2 mo l I Na OH 调节至不 同的 p H， 再补加前体 和葡萄糖 考察其对产物转 化 的影响 ， 结果 如 图 4所 示 。 可 以看 出 S AM 产 量 对 p H 比较 敏 感 ， 最 适 p H 为 5 0 ， 可 能 由于 p H 对 酵 母 代 谢 和 S AM 合成酶 活性的影 响造 成 。 零 18 6 奏 图 3补加 蛋 氨酸 浓度 对 产量 的影 响 Fi g 3 Ef f ec t s of m e t hi oni n e c onc e nt r a t i on on pr oduc t i on p H o f b i o t r a n s f o r ma t i o n 图 4 p H 对产 量 的影 响 ( 细 胞密 度 2 O g L) Fi g 4 Ef f e c t of pH on t he pr oduc t i on wi t h c e l l d e n s i t y 2 O g L 维普资讯 第 4期 刘 惠 等 酿 酒酵母 生 物转 化蛋 氨 酸生产 S 一 腺 苷一 L 一 蛋 氨 酸 3 1 3 3 2间歇 培 养 生 产 S AM 酿酒 酵母 间歇培 养过 程 中 由于 C r a b t r e e效应 会 产生 部分 乙醇 ， 3 0 g L的初始 糖浓 度培 养 2 4 h 后 只得到 DC W 一5 g L的酵母 细 胞 ， 再继续 补加 3 0 g L葡 萄糖 ， 1 g L蛋 氨酸 ， 考察 不 同溶 氧浓度 ( D0) 下 的底 物 消 耗 、 细 胞 生 长 和产 物 积 累情 况 。 图 5 6为转化 过程溶氧分 别控 制在 2 O 及 3 O 的底物 消耗、 产物积 累以及 细胞生长情 况 ， 可以 看 出在补糖 和蛋氨酸 以后 细胞继续 以较快 的速 度生长 ， 在 葡萄糖耗尽后 ， 酵母继续利 用乙醇来生成产 物 和合成 细胞 物质 ， 直至消耗完 全。 S AM 的积累同步于酵母细胞 密度 ， 当乙醇消耗完全 ， 生长与 S AM 积 累便停止 。 由于 S AM 合 成除蛋氨酸 以外还需要 消耗大量 的 ATP作为前体 ， 当C源耗尽后 ， 产 物积 累停 止 在 意 料 之 中 。 l 专 Ti me o f bi o t r a n s f o r m a t i o nh 图 5 转 化过 程 中溶 氧对 葡 萄糖 和 乙醇 的 消耗 曲线 的影 响 Fi g 5 Ef f e c t o f d i s s o l v e d o x y g e n c o n c e n t r a t i o n o n gl u co s e a nd e t ha nol de pl e t i on dur i ng bi ot r a ns f or ma t i on Ti m e o f bi o t r a n s f o r ma t i o nh 图 6 转 化过 程 中两 种溶 氧水 平 下酵母 细胞 生长 及 产 品 Ad o Me t的积 累过 程 Fi g 6 Ce l l g r o wt h a n d p r o d u c t s a c c u mul a t i o n a t d i f f er ent di s so l ve d oxy ge n c on ce nt r at i o ns 当溶 氧 由 2 0 增加 至 3 O 时 ， 葡 萄糖 消耗加快 ， 乙醇 积 累降低 而消耗加 快 ， 酵母 细 胞 的生 长加 快 ， 而 S AM 产物 积累速 度也增 加 ， 这一方面 同酵母 密度 的增加有 关 ， 胞 内产物 的积 累 同细胞 的生 长 关 系 比较复杂 ， 细胞 的生长可 以促进产物合成 能力 ， 同时溶 氧提高后 ， 可 以提高 ATP的供 给能 力 ， 为 S AM 生物合 成 提供前体 之一 ATP和合成 的能量 需要 ， 但 过量 的生长 又会 导致碳 源 、 能量 及前 体 的 消耗使得产 物得率降低 。 4 结 论 通 过摇 瓶考察 和筛选 ， 发 现酵母 菌 中酿酒 酵母 ( z j u s l及 z j u s 2 ) 在蛋 氨酸存在 的前 提下具 有 明显 的积 累 S AM 能力 ， 确定采用 酿酒 酵母 z j u s l补加蛋氨 酸来生产 S AM。 通 过摇 瓶 各单 因素 考察 确 定 了酵母 提取 物 、 补 加 葡 萄糖 和蛋 氨 酸对 碳 源利 用 、 细胞 的生 长 和 S AM 产 量 的 影 响 。 通 过 1 5 L B B r a u n罐 的 间歇 生产 考察 了溶 氧对 转 化 过程 的影 响 ， 转 化 过程 中细 胞 的生 长 与 S AM 的合成在 C源耗尽后 停止 ， 溶 氧的增加有利 于 C源利用 ， 细胞生 长以及产物 产量增 加 。间歇 生 产 中产量达 到 8 0 0 mg L， 酵母 密度 1 5 g I ， 蛋 氨酸转化率达 约 3 O ， 同文献 3 ， 4 相 比 ， 产量 较高 ， 而 且可 以推测 当氧供应能力进 一步提高后 ， 产 量还会增加 。 参考文献 ： 1 3 L u S C Re v i e w a r t i c l e ：S - Ad e n o s y l me t h i o n i n e J I n t e r J B i o c h e m c e l l B i o ，2 0 0 0 。3 2 l 3 9 1 3 9 5 蕊匾 蠹 函 舳 加 m 5 0 维普资讯 3 1 4 化 学反 应 工程 与工 艺 2 0 0 2钽 2 Gr o s s A，Ge r e s h S，Wh i t e s i d e s G MEn z y ma t i c s y n t h e s i s o f S a d e n o s y l L me t h i o n i n e f r o m L me t h i o n i n e a n d ATP J Ap p l Bi o e h em Bi o t e c h， 1 9 8 3， 8：4 1 5 4 22 3 S c h l e n k F，Z y d e k C R，E h n i n g e r D J ，e t a 1 Th e p r o d u c t i o n o f S a d e n o s y l L me t h i o n i n e a n d S - a d e n o s y l L e t h i o n i n e b y y e a s t J E n z y mo l o g i a ，1 9 6 5 ，2 9：2 8 3 4 S h i o mi N，F u k u d a H， Mu r a t a K， e t a 1 I mp r o v e me n t o f S Ad e n o s y l me t h i o n i n e p r o d u c t i o n b y i n t e g r a t i o n o f t h e e t h i o n i n e r e s i s t a n c e g e n e i n t o c h r o mo s o me s o f t h e y e a s t S a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a e J Ap p l Mi c r o b i a l Bi o t e c h n o l ，1 9 9 5 ，4 2 ：7 3 0 7 3 3 5 3 S h e Q B，Na g a o I ，Ha y a k a wa T， e t a 1 A s i mp l e HP LC me t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f S Ad e n o s y l me t h i o n i n e a n d S - Ad e n o s y l h o mo c y c y s t e i n e i n r a t t i s s u e s ： t h e e f f e c t o f Vi t a mi n B 6 d e f i c i e n c y o n t h e s e c o n c e n t r a t i o n s i n r a t l i v e r J B i o c h e m b i o p h y s r e s c omm u， 1 9 9 4， 2 5 ( 3)：】 7 4 8 】 75 4 Pr o duc t i on o f S- a de no s yl - - L- - m e t hi o ni ne Us i n g S a c c ha r om y c e s Ce r e v i s i a e by Bi o c onv e r s i o n o f L m e t hi o ni ne LI U Hu i ，LI N J i a n p i n g， W U J i a n p i n gCEN P e i l i n ( I n s t i t u e o f Bi o e n g i n e e r i n g，De p a r t me n t o f Ch e mi c a l En g i n e e r i n g a n d Bi o e n g i n e e r i n g， Z he j i a n g Un i v e r s i t y，Ha n g z ho u，3 1 0 0 2 7，Ch i n a ) Ab s t r a c t ： Pr e c u hu r e d S a c c h a r o my c e c e r e v i s i a e( z j u s 1 )wa s c h o s e n t o p r o d u c i n g S a d e n o s y l L me t h i o n i n e ( Ad o M e t )i n t he p r e s e n c e o f me t hi o n i n e a f t e r s c r e e n i n g Ef f e c t s of ye a s t e xt r a ct s，su ppl e me n t e d g l u c o s e a n d L me t h i o n n e ，p H v a l u e o n t h e b i o t r a n s f o r mi n g p r o c e s s e we r e s t u d i e d i n s h a k e f l a s k s Ba t c h s t u d i e s i n a 1 5 L BBr a u n f e r me n t o r i n d i c a t e d hi g he r d i s s o l v e d o x y g e n c o n c e n t r a t i o n we r e be ne f i c i a l f or ca r bon s ou r c e ut i l i z i ng， c el l gr owt h a nd pr odu c t s f o r m a t i o n The vol um e vi e l d r e a c h e d 8 0 0 mg L o f Ad o Me t wi t h 1 5 g D C W 1 o f b i o ma s s a n d a b o u t 3 O 6 o f c o v e r s i o n r a t i o o f me t hi o ni ne Ke y wo r d s ：S- a d e n o s y l L me t h i o n i n e ( Ad o M e t ，SAM ，S AM e ) ；s a c c h a r o my c e c e r e v i s 1 a e： L- m e t hi onn e； bi ot r ans f or m 维普资讯 第 1 8卷第 4期 2 0 0 2年1 2 月 化 学 反应 工 程与 工艺 Chemi c a l Re a c t i o n Engi ne er i ng a nd Te c hnol ogy V ol 1 8No 4 Dee， 2002 文 章编 号 ：1 0 0 1 7 6 3 1 ( 2 0 0 2 ) 0 4 -0 3 1 5 0 8 蛋 白质 酶 促 水 解 过 程 集 总动 力 学 研 究 史 德 青 ， 何 志 敏 ， 齐崴 ( 天 津大 学 化工 学 院化 学工 程研 究所 ， 天 津3 0 0 0 7 2 ) 摘 要 ： 针对 蛋 白质酶促 水解 反应 特点 ， 根据 水解 反应 机理 ， 对水 解过程 进行 合理 的假 设 ， 将水 解产 物按 分 子 量 分段 集 总 ， 构 建 出集 总反应 网络 ， 用包 含酶 失 活、 产 物 抑制 和底物 抑制 的本 征 动力 学方 程描 述 集 总组 分 的 反应 行为 。以牛血 清 白蛋 白 胰 蛋 白酶反 应体 系 为具体研 究对 象 ， 建 立了 4集总 动力 学模 型 。根据 分层 估 算 的原理 ， 进行 了动力 学参 数 的测 定 ， 经 不 同原 料组 成 和反应 条件 的实验验 证 ， 所建 立 的集 总 动力 学模 型 具 有 良好 的拟 合性 和外推 性 。 关键 词 ：蛋 白质 ； 酶 促水解 ； 集总 ； 动 力学 模型 ； 参 数估算 中 图分类 号 ：T Q0 3 3 文献 标识 码 ：A 1 引 言 蛋 白质酶促水解 是在水 溶液 中通 过酶 的催 化作用 ， 使蛋 白质 中的肽键 断裂 ， 生成 胨 、 肽 等低分 子 量产物 的生化反应过程 。蛋 白水 解得 到的某 些多肽具有生物 活性 ， 对人 体健康十分 有益 ， 可作 为保 健 食 品甚 至药 品 ， 如 酪蛋 白水解得 到可促进 钙 吸收 的酪蛋 白磷 肽 C P