三种葛根总黄酮提取工艺的比较及优化.pdf

第 1 O卷 第 5期 2 0 0 8年 9月 辽宁农业职业技术学院学报 J o l l ma l o f L i a o n i n g A c u l t u r a l C o U e g e Vo 1 1 0No 5 S e p t 2 o o 8 三种葛根 总黄酮提取 工艺的 比较及 优化 汤晓 ， 朱建华 ( 宁波职业技术学院 华丰学院 宁波 3 1 5 8 o 0 ) 摘 要 ： 对葛根总黄酮的三种提取工艺进行了比较及优化。结果表明， 乙醇回流提取的最佳工艺条件为乙醇浓度 7 0 ， 料液比 1 ： l 0， 提取时间 1 h ， 提取温度 8 0 ， 最佳提取率为 6 2 8 。超声提取的最佳工艺条件为乙醇浓度 7 0 ， 料液比 1 ： l 5， 提取时间2 0 mi n ， 超声温度 6 0 ， 最佳提取率为 5 6 1 。微波辅助提取的最佳工艺条件为乙醇 浓度 6 O ， 料液比 1 ： 2 0 ， 微波处理时间4 0 s ( 3次) ， 中高火处理， 最佳提取率为8 5 7 。微波辅助提取的效果最好， 具有快速、 节能、 提取率高等优点。 关 键词 ： 葛根； 黄酮 ； 乙醇回流提取； 超声提取； 微波辅助 中图分类号 ： Q 5 0 3 文献标识码 ： A 文章编号 ： l 6 7 l 一 0 5 1 7 ( 2 0 0 8 ) O 5一 o 0 0 l 一 0 4 葛根 是豆科植物 葛的块根 ， 主要成分为 黄酮 类、 芳香类、 三萜类等， 是我国传统的药食两用植物。 其 中的总黄酮具有抗氧化、 抗菌、 抗癌作用 ， 能够防 治骨质疏松 ， 对气管炎、 冠心病及妇科疾病也有一定 疗效。已有研究证明葛根总黄酮的临床疗效优于银 杏黄酮 ， 因而深入研究葛根总黄酮成为功能食品、 医 药工业领域的热点问题。 葛根总黄酮的传统提取方法有水提法、 醇 回流 法 、 醇渗漉法 、 浸渍法等 ， 而微波辅 助提取 以及 超声 提取等则为新兴 的提取工艺 。由于醇渗漉法 、 浸渍 法的生产周期较长， 溶剂用量也较大， 因此， 本文对 生产周期较短的醇 回流法、 微波辅 助法 以及超声提 取法进行 了优化及 比较 ， 以期为提高葛根资源 的综 合利用提供理论依据。 1 材料 与方法 1 1 材料与仪器 1 1 1 材料 野葛根 ， 产于浙江省宁波市北仑区九峰 山风景 区， 洗净后晾干 ， 切片 ， 于 8 0 c c下烘干， 粉碎备用。 1 1 2仪 器 7 5 2 N型紫外 一 可见分光光度计( 上海精密科学 仪器有限公 司) ， 美的家用 微波炉 ， 超声 清洗器 ( 宁 波市鄞州甬兴实验仪器有限公司) ， 数显恒温水浴 锅( 上海申胜生物技术有限公司) 。 1 1 3试 剂 葛根素标准品( 南京 T c M中药研究所) ， 其余 收稿 日期： 2 O o 8一 o 9 0 1 作者简介： 汤晓( 1 9 8 l一) ， 女 ， 浙江宁波人， 硕士学位， 主要 研究方向为生化物质分离。 试剂均为国产分析纯。 1 2实验 方 法 1 2 1 乙醇 回流提 取 设计乙醇浓度 、 料液 比、 提取时间、 提取温度的 四因素三水平正交试验 ， 共有 9组试验 ， 每一组平行 测定三次 ， 共计 2 7次试验。因素水平设计见表 l 。 表 l 正交试验 中的影响 因素及水 平( 乙醇回流提取 ) 1 2 2 超 声提取 l _ 2 2 1 单 因素试验条件优化 分另 对超声时间 、 超声温度 、 料液比和乙醇浓度 进行考察。超声 提取 前 ， 先 用一定 浓度 乙醇 预浸 3 0 mi n 。 1 2 2 2 正交试验条件优化 以单因素试验结果为依据 ， 设计超声时间、 超声 温度、 料液 比、 乙醇浓度的 四因素三水平正交试验 ， 共有 9组试验 ， 每一组平行测定三次 ， 共计 2 7次试 验 。因素水平设计见表 2 。超声提取前 ， 先 用一定 浓度乙醇预浸 3 0 m i n 。 表 2 正 交试验 中的影响因素及 水平( 超声提取 ) 水 A B C D 平 超声时间( i )超声温度( o C) 料 液比( g 1 ) 乙醇浓度 ( ) 1 2 3微 波辅 助提 取 辽宁农 业职业技术学 院学报 第 1 0卷 1 2 3 1 单因素试验条件优化 分别对微波强度 、 料液比、 微波辐射时间和乙醇 浓度进行考察 。微波处理前 ， 先用 一定浓度乙醇预 浸 3 0 m i n 。微波处理后 ， 待溶剂冷却再 次进行微波 处理 ， 共计 3次。 1 2 3 2正交试验条件优化 以单因素试验结果为依据， 设计乙醇浓度、 料液 比、 、 微波辐射时间 、 微波强度的四因素三水平正交 试验 ， 共有 9组试验 ， 每一组平行测定三次 ， 共计 2 7 次试验。因素水平设计见表 3 。微波处理前 ， 先用 一 定浓度乙醇预浸 3 0 m i n 。微 波处理后 ， 待溶剂冷 却再次进行微波处理 ， 共计 3次。 表 3 正交试验 中的影响因素及水平( 微波辅助提取 ) 水 A B C D 平乙醇浓度 ( ) 料液比( g m1 )辐射时 问( 3次 ，s )微波强度 1 2 4 葛根总黄酮含量的测定 1 2 4 1 标准曲线的制作 准确称取葛根素对照品 5 mg ， 置 于 2 5 mL容量 瓶中， 加入 9 5 乙醇溶解并稀释至刻度 ， 摇匀 ， 分别 精确吸取0 1 ， 0 2 ， 0 3 ， 0 4 ， 0 5 ， 0 6 ， 0 7 ， 0 8， 0 9 ，1 0于 l O m L容量瓶 中， 并各加 9 5 乙醇 1 0 m I ，再加蒸馏水稀释至刻度， ， 摇匀 。另取 9 5 乙 醇 1 0 m L置 l 0 mL容量瓶中， 加蒸馏水至刻度 ， 作空 白对照， 在 2 5 0波长处测定吸光度。以浓度为横坐 标 ， 吸光度值为纵坐标 ， 绘制标准曲线。 1 2 4 2 葛根总黄酮提取率的测定 精确吸取一定量的葛根提取液置于 l 0 mL容量 瓶中， 加入 9 5 乙醇 1 0 m L ， 用蒸馏 水稀释至刻度 ， 按上述操作方法， 在 2 5 0 n m波长处测定 吸光度 ， 根 据标准曲线方程计算样品溶液 中总黄酮 的含量 。 葛根总黄酮的提取率按以下公式计算 ： 提取率 =( 样 品中总黄酮含 量 稀释倍数 l 0 3 ) ) 样品重( g ) 1 0 0 2 结果与讨论 2 1 乙醇回流提取正交优化结果 在前期实验中， 已对乙醇 回流提取的单 因素试 验作 了考察。乙醇回流提取葛根总黄酮的正交试验 结果如表 4所示。 表 4 正交实验结果及分析 ( 乙醇 回流提取 ) A B C D 葛根黄酮 乙 度 提 问提 度 笔 喜 ( ) ( g m 1 ) ( h ) ( 0 c) 一 _ 3 6 9 9 4 4 3 7 9 4 2 6 7 2 7 l O 2 6 7 4 7 7 6 6 3 1 5 2 8 2 4 2 l 6 2 5 9 41 6 3 8 36 9 9 4 2 8 9 8 3 l 2 5 5 6 4 2 6 l 6 2 9 5 8 8 3 5 3 l l l 3 O 2 7 由极差分析可知， 四个影响因素在本体系中的 影响强弱为： 料液比 提取温度 提取时间 乙醇 浓度。最终确定乙醇回流提取工艺条件的最佳优化 组合为： A 2 B l C l D l 。即选择 7 0 的乙醇水溶液作 为溶剂， 料液 比为 l ： 1 0 ( m 1 ) ， 提取时间为 l h ， 提 取温度为 8 0 。经实验后 ， 乙醇 回流提取所得葛根 黄酮的最佳提取率为 6 2 8 。 2 2 超声提取条件优化结果 2 2 1 单因素试验结果 2 2 1 1 超声 时间的选择 超声 时间分别 为 1 0 mi n ， 2 O m i n ， 3 0 m i n ， 4 0 m i n ， 超声温度 5 0 ， 料液比为 l ： l O ( g m 1 ) ， 乙醇浓度为 7 5 。实验结果如图 l 所示。 目l _J n J 图 1 提取时间对提取效果 的影响 由图 l 可见， 随着超声时问的延长， 葛根黄酮的 提取率显 著增加 ， 3 O m i n时达到最大值。当时间进 一 步延长， 提取率反而下降 ， 这可能是 由于长时间下 超声波对细胞 的破碎作用 ， 导致细胞 内非黄酮类物 质进一步溶出， 从而降低 了总黄酮的提取率。综合 J 二 述实验结果 ， 选择 3 O mi n的超声提取时间为宜。 2 2 1 2 超声温度 的选择 超声温度分别为 4 0 ， 5 0 ， 6 0 ， 7 0 c I 二 ， 超声 4 6 O 3 4 6 5 6 l 弱 ； 3 踟 暑 踟 吾 5 鲫 ； m ； ；m ； l l l l l l 1 l l 加 踟 1 2 3 4 5 6 7 8 9一 U R 第5期 汤 晓等：三种葛根总黄酮提取工艺的比较及优化 3 时间为3 0 mi n ， 料液 比为 l ： l O( m1 ) ， 乙醇浓 度为 7 5 。实验结果如图2所示 。 5 5 5 0 45 甜 40 蹑 轻 3 趟 户 撮 厦( ) 图 2 超声 温度对提取效果的影响 由图 2可见 ， 当超声温度上升时 ， 可显著提高葛 根黄酮的提取率。进一步提高超声 温度 ， 反而致使 总黄酮提取率降低 ， 分析原因 ， 可能是 由于在超声提 取条件下 ， 葛根总黄酮对热稳定性不好所致 。综合 上述实验结果 ， 选择 5 0 的超声温度为宜。 2 2 1 3料液 比的选择 料液 比分别 为 l ： 5 ， l ： 1 0 ， l ： l 5 ， l ： 2 0 ( m1 ) ， 超 声时间 为 3 0 mi n ， 超声 温 度 为 5 0 c c， 乙醇 浓 度 为 7 5 。实验结果如图 3所示。 科 t R m I】 图 3 料液比对提取效果 的影响 由图 3可见 ， 当料液比由 l ： 5上 升至 l ： l 0时 ， 能够明显促进葛根 中总黄酮的浸出。随后 ， 葛根黄 酮的提取率下降。综合上述实验结果 ， 选择 l ： l 0的 料液 比为宜。 2 2 1 4 乙醇 浓度的选择 乙醇浓度分别 为 6 5 ， 7 0 ， 7 5 ， 8 0 ， 超声 时间为 3 0 m i n ， 超声温度为 5 0 。 C， 料液比为 l ： l 0 ( m 1 ) 。实验结果如图4所示。 己耐浓 度 ( 图 4 乙醇浓度对提取效果的影响 由图 4可见 ， 当乙醇浓度为 7 0 时， 葛根黄酮 的提取率最高 ， 增加乙醇浓度 ， 提取率反而下降， 因 此 ， 乙醇浓度以 7 0 为宜 。 2 2 1 。 5 正交试验结果 超声提取的正交试验结果如表 5所示。 表 5 正 交实验 结果及分 析( 超声提取 ) 由极差分析可知 ， 四个影响 因素在本 体系中的 影响强弱为： 料液比 超声 温度 超声 时间 乙醇 浓度。最终确定超声提取工艺条件的最佳优化组合 为： A 。 B 。 C 。 D 。即选择超声时问为 2 0 m i n ， 超声温度 为 6 0 ， 料液 比为 l ： l 5 ( g m1 ) ， 乙醇浓度为 7 0 。 经实验后 ， 超声提取所得葛根黄酮的最佳 提取率为 5 6 1 。 2 3 微波辅助提取条件优化结果 2 3 1 单因素试验结果 2 3 1 1 微波强度的选择 微波强度分别 为中低火 、 中火 、 中高火及高火 ， 微波辐射时 间 3 0 s ， 作 用 3次 ， 料液 比为 l ： 2 0 ( g m 1 ) ， 乙醇浓度为 5 O 。实验结果如图 5所示 。 图 5 微波强度对提取效果的影响 由图 5可见 ， 当微波强度从 中低火凋节为 中火 时 ， 葛根黄酮 的提取率从 5 2 1 上升为 8 O 6 ， 增 4 辽宁农业职业技术学院学报 第 1 0卷 幅显著。当微波强度进 一步提高 ， 黄酮提取率下降， 这可能是由于微波功率大， 导致温度过高 ， 而葛根总 黄酮对热稳定性不好 ， 从而导致提取率下降。综合 上述实验结果， 选择中火的微波强度为宜。 2 3 1 2 料液比的选择 料液比分别为 1 ： 2 0 ， l ： 2 5 ， l ： 3 0 ， l ： 3 5 ( g m 1 ) ， 微波强度为 中火 ， 微波辐射 时间 3 0 s ， 作用 3次 ， 乙 醇浓度为 5 O 。实验结果如图 6所示 。 科 散 比 g ， 憎I j 图 6 料液比对提取效果的影响 由图 6可见 ， 当料液比由 l ： 2 0增至 l ： 2 5时， 葛 根黄酮的提取率 随之提高， 但 当进一步提高料液 比 时 ， 总黄酮 的提取率呈下降趋势 ， 这可能是 由于水包 裹在被粉碎 的葛根表面 ， 吸收了微波能 ， 从而阻止了 葛根对微波能的吸收。综合上述实验结果 ， 选择 l ： 2 5 ( g m 1 ) 的料液比为宜。 2 3 1 3 辐射时间的选择 辐射时间分别为 2 0 s ， 3 0 s ， 4 0 s ， 5 O s ， 作用 3次， 微波强度为中火 ， 料液比为 l ： 2 5 ， 乙醇浓度为 5 0 。 实验结果如图 7所示。 依 扳描射町 t s ) 图 7辐射 时间对提取效果的影响 由图 7可见 ， 当辐射时间从 2 0 s 上升至 3 0 s ， 由 于微波对细胞的破壁作用与加热作用 ， 使葛根黄酮 的提取率提高。当辐射时间延长， 提取率反而下降， 这可能是 因为微波继续处理后 ， 温度上升 ， 一方面乙 醇溶液暴沸 ， 溶剂挥发较多； 另一方面， 葛根粉 中残 留的淀粉糊化后 ， 增加溶液粘度， 也会导致部分黄酮 被淀粉糊吸附， 从而降低 了总黄酮的提取率。综合 上述实验结果， 选择 3 0 s的辐射时间为宜。 2 3 1 4 乙醇浓度的选择 乙醇浓度分别为 5 0 ， 6 0 ， 7 0 ， 8 0 ， 微波 强度为中火 ， 料液 比为 l ： 2 5 ， 微波辐射时间 3 0 s ， 作 用 3次。实验结果如图 8所示。 已 醇 乘厦 ) 图 8 乙醇浓度对提取效果的影响 由图 8可见 ， 当乙醇浓度为 6 0 时 ， 葛根黄酮 的提取率最高 ， 增加 乙醇浓度 ， 提取率反而下降 ， 因 此 ， 乙醇浓度以6 O 为宜。 2 3 1 5 正交试验结果 微波辅助提取 的正交试验结果如表 6所示。 表 6正交实验结果及分析( 微波辅助提取 ) 由极差分析可知 ， 四个影 响因素在本体系中的 影响强弱为 ： 料液比 乙醇浓度 辐射时间 微波 强度。最终确定微波辅助提取工艺条件的最佳优化 组合为 ： A B C 3 I ) 3 。即选择 6 0 的乙醇水溶液作为 溶剂 ， 料液比为 l ： 2 O ( g m 1 ) ， 辐射时间为 4 O s ， 微波 强度为中高火。经实验后 ， 微波辅助提取所得葛根 黄酮的最佳提取率为 8 5 7 。 2 4 三种提取工艺的比较 由实验结果可知 ， 在上述三种葛根总黄酮的提 取工艺中， 微波辅助提取的效果最好 ； 经优化后 ， 葛 根黄酮的提取率可达 8 5 7 ， 并且( 下转第 L 5页) 第 5期 付政 义等 ：南瓜制 种田套种粘玉 米试验研究 1 5 高于对 照 区， 处理 区南 瓜种 子平 均千粒 重 1 l 5 7 5 g ， 对 照 区 平均 千粒 重 9 6 7 5 g 。 表 3南瓜种子平均千粒重 3 结论 3 1 降低南瓜果实 日灼病 的发病 率 连续 4年 的南 瓜制种 田套种粘玉米试验 ， 均 表现为处理 区内南瓜生长前期粘玉米株较矮， 不影响南瓜光合作用并起 到防风害和固定秧蔓的作用。南瓜果实膨大至成熟期 ， 粘玉 米长势较旺起到 了遮荫作用避免了强光照射， 果实病害较 轻 ， 很少发生烂瓜。在对照区内南瓜生长后期 ， 由于叶片不 能遮盖膨大的果实， 并因缺少套种粘玉米遮荫， 而受到高温 影 响和强光 照射 ， 南瓜果 实大 量发生 日灼病 ， 病 瓜发生 不 同 程度腐烂。试验结果表明在处理区内 日灼病平均发病率为 0 3 6 ， 对照区果实 日灼病平均发病率为 2 6 5 。可见南 瓜制种田套种粘玉米防止日灼病具有明显效果。从根本上 解决了南瓜制种因日灼病危害而减产的问题 3 2 提 高南瓜种子产量和质量 在试验调杏 中看到 ， 处 理 区内果 实 日灼 病很轻 ， 果形 整 齐一 致 ， 烂 果极 少 ， 平均 每 6 6 7 m 南 瓜 种子 产量达 3 3 8 k g 。 对照区内往往发生风沙危害， 伤害较重的植株长势减弱， 枝 蔓较短， 果实不整齐， 烂瓜较多， 平均每 6 6 7 m 产种量为 2 2 6 k g ， 每年处理区比对照区的种子产量增加 1 1 2 k g 。试验 中 处理区采收的果实后熟过程不易发生腐烂， 洗出的种子， 颜 色纯正， 有光泽且充实饱满； 对照区采收的果实后熟过程 中 易发生腐烂 ， 洗出的种子瘪籽较多， 成 熟度不够， 千粒重下 降。试验表 明处理 区采 收 的种 子平 均千粒 重为 1 l 5 7 5 g ， 对 照的种子平均 粒重 为 9 6 7 5 g ， 处 理 区种 子 品质 明显优 于对 照 区。 3 3 提 高经济效益 在处理区内每年 6 6 7 m 平均多收粘玉米 3 2 5 0穗， 但粘 玉米种植也不能过密， 否则会影响南瓜光合作用； 也不能过 稀， 否则起不到遮荫作用， 只有南瓜与粘玉米合理套种， 才能 获得南瓜种子 和粘 玉米 双丰收 。 连续 4年开展的南瓜杂交制种田套种粘玉米研究充分 证明， 我省进行中、 晚熟南瓜种子生产， 应注重生育前期促进 植株生长， 后期预防南瓜 日灼病避免烂瓜。这是提高南瓜种 子产量的核心问题。本项研究采用南瓜与粘玉米套作的方 式， 较好地解决了南瓜种子生产的关键问题， 取得了较好 的 试验效果， 具有一定的推广价值。 一_ _ - 一一- - - 一- 一+- - 一- _ - - - 一一 ( 上接 第 4页) 具有提取速度快、 节省能源等优点。超声提取工艺经优化 后， 葛根黄酮的最佳提取率为 5 6 1 ； 尽管该数值低于乙醇 回流提取的最优值( 6 2 8 ) ， 但超声提取所用时间短， 提取 溶剂用量少， 且方法简便， 因此 ， 相比乙醇回流提取仍具有优 势。 3 结论 3 1 乙醇回流提取葛根总黄酮的最佳工艺条件为： 乙醇浓 度 7 O ， 料液 比 1 ： 1 0( m 1 ) ， 提取 时 间 1 h ， 提 取 温度 8 O ， 最佳 提取 率为 6 2 8 。 3 2 超声提取的最佳工艺条件为： 乙醇浓度 7 0 ， 料液 比 l ： l 5 ( m 1 ) ， 超声时间 2 0 m i n ， 超声温度 6 0 ， 最佳提取率为 5 6 1 。 3 3 微波辅助提取的最佳工艺条件为： 乙醇浓度 6 0 ， 料液 比 1 ： 2 O ( g r n 1 ) ， 辐射时间4 0 s ( 辐射 3次) ， 微波强度中高火 ， 最 佳提取率 为 8 5 7 。 3 4 在三种提取工艺中， 微波辅助提取的效果最好， 具有提 取率高、 节时、 节能、 简便等优点。与传统的乙醇回流提取相 比， 超声提取的提取率尽管不高， 但能够节省溶剂、 节约时 间， 操作也简便， 因此仍具有明显优势。 参考文献 ： 1 崔苏镇，彭学莲葛根的药理作用研究概况 J 时珍国 药研究 ，1 9 9 8， 9 ( 3 ) ： 2 4 6 2 4 7 2 华辉， 郭勇黄酮类化合物药理研究进展 J 广东药 学 ， l 9 9 9 ， 9 ( 4 ) ： 91 2 3 白兰莉， 蒋柏泉， 黄庆荣， 等葛根总黄酮提取新工艺的 研究 J 南昌大学学报( 工科版) ， 2 o 0 6 ， 2 8 ( 3 ) ： 2 2 7 2 30 The op t i mi z a t i O n a nd CO mpa r i s O n O f Th r e e Ex t r a c t i 0 n Te c h nO l 0 g i e s O f Fl a V O nO i d s f r O m P e r 0 n 6 TANG Xi a 0 ZHU J i a n h u a ( D e p a r t m e n t o f Hu a F e n g ， N i n g b o P o l y t e c h n i c C o 1 1 e g e ， N i n g b o ， 3 l 5 8 0 O ) Ab s t r ac t ：T hi s p a p e r o p t i mi z e d t hr e e k i n d s o f e x t r a c t i 0 n t e c h n o l o g i e s o f na v o n 0 i d s f o m JP e ， 也矗0 0 6 0 0 a n d c o mp a r e d t h e m wi t h e a c h o t h e r Th e r e s u l t s s h o we d t h a t t he o p t i mi z e d c o n d i t i 0 n s o f e t h a n o le x t r a c t i n g we r e a s f l0 l l o w s ：7 0 e t h a n 0 I e x t r a c t i n g a t 8 0 c c f 0 r 1 h，a n d t h e r a t i 0 o f ma t e r i a I t o s 0 l v e n t i s l： 1 0，u n d e r w h i c h t h e e x t I |a c 。 t i o n r a t e w a s 6 2 8 Ho we v e r ， 8 5 7 e x t r a c t i o n r a t e c o u l d b e o b t a i n e d b y me a n s o f e t h a n o l e x t r a c t i n g w i 山 mi 。