山茶叶片可溶性蛋白双向电泳技术的建立.pdf

收稿日期:2 0 0 7 - 1 0 - 0 8 基金项目: 国家林业局9 4 8项目(2 0 0 1 - 2 4) 作者简介: 周蕴薇, 博士后在站, 副教授, 硕士生导师, 研究方向: 园林植物育种,E - m a i l:z h o u y u n w e i h o t m a i l . c o m 通讯作者: 戴思兰, 教授, 博士生导师, 研究方向: 园林植物育种, E - m a i l:s i l a n d a i s i n a . c o m 双向电泳技术是目前蛋白质组学研究的关键技术,包括蛋白质的提取、等电聚焦(I s o e l e c t r o f o c u s i n g, I E F) 、S D S - P A G E和凝胶染色等步骤。自1 9 7 5年P . H . OF a r r e l l建立该技术以来, 第一向已从载体两性电解 质p H梯度(C a r r i e r A m p h o l y t ep HG r a d i e n t) 等电聚焦发展到固相p H梯度(I m m o b i l i z e dp HG r a d i e n t,I P G) 等 电聚焦, 使双向电泳技术的分辨率和重复性得到了很大提高 1 。这一技术在生物蛋白质研究中得到了广泛 的应用, 目前已成为分离蛋白的有效手段。其在微生物和动物蛋白质研究方面的应用较多, 在植物特别是 木本植物蛋白的研究方面应用的相对较少。 由于木本植物组织中的色素、 酚和醌等次生代谢物质较细菌和 草本植物中的多, 所以双向电泳技术在木本植物的应用上受到很大的限制, 且电泳分析通常很难获得满意 的结果。 山茶(C a m e l l i a j a p o n i c a L .) 是中国的传统名花, 为常绿阔叶树种, 抗寒育种对于扩大其栽培范围具有重 要意义, 且已有了不少品种 2 。但是, 传统的抗寒育种方法周期长, 通过双向电泳分析山茶低温诱导前后蛋 白质图谱的差异, 寻找到与低温相关的蛋白质, 并进一步分离相关基因, 这对揭示山茶的抗寒机理及加速 其抗寒育种进程都具有重要意义。 但山茶富含酚类、 脂类和醌类等次生代谢物质, 双向电泳有一定的难度, 国内外未见报道。以3年生青岛居群( 俗称“ 耐冬” ) 山茶的叶片为材料, 利用固相p H胶条, 初步建立了山 茶叶片可溶性蛋白的双向电泳技术体系, 以期为进一步的山茶低温诱导蛋白的研究奠定基础。 山茶叶片可溶性蛋白双向电泳技术的建立 周蕴薇 1,2 董文珂 1 刘艳萍 2 戴思兰 1 (1北京林业大学园林学院, 北京1 0 0 0 8 3; 2东北林业大学园林学院, 哈尔滨 1 5 0 0 4 0) 摘要: 建立了山茶低温诱导蛋白研究中叶片蛋白双向电泳技术体系.采用固相p H胶条在I P G p h o r T M等电 聚焦系统上进行等电聚焦, 在E t t a nT M D a l t高通量电泳仪上进行S D S - P A G E电泳, 以银染法染色, 得到了分离效果 良好的蛋白质双向电泳图谱。讨论了蛋白沉降方法、 蛋白提取液的组成及其他技术环节对蛋白图谱的影响。 关键词: 山茶叶片蛋白双向电泳 I mp r o v e me n ti nT w o - d i me n s i o n a l G e l E l e c t r o p h o r e s i so fP r o t e i n s i nt h eC a m e l l i aj a p o n i c aL e a f Z h o uY u n w e i 1,2 D o n gWe n k e 1 L i uY a n p i n g 2 D a i S i l a n 1 (1C o l l e g eo f L a n d s c a p eA r c h i t e c t u r e,B e i j i n gF o r e s t r yU n i v e r s i t y , B e i j i n g1 0 0 0 8 3; 2 C o l l e g eo f L a n d s c a p eA r c h i t e c t u r e,N o r t h e a s t F o r e s t r yU n i v e r s i t y , H a e r b i n1 5 0 0 4 0) A b s t r a c t:T h i s p a p e r r e p o r t e dt h e i m p r o v e m e n t i n2 - Dg e l e l e c t r o p h o r e s i s p r o t e o m e o f t h e c o l d - i n d u c e dp r o t e i n s o f t h e l e a f o f C a m e l l i a j a p o n i c a .A n I P G p h o r T Mu n i t w i t h i m m o b i l e p Hg r a d i e n t s t r i p s w a s u s e d i n a n d t h e E t t a n T MD a l t s y s t e mi n S D S - P A G E .T h e2 - Dg e l w a s s t a i n e db ym e t h o d s o f s i l v e r,a n dt h eb e t t e r s e p a r a t i n gp r o t e i np a t t e r nc o u l db eg a i n e db yt h i s m e t h o d . T h e e f f e c t o f p r o t e i ns e d i m e n t a t i o nm e t h o d,c o m p o s i t i o no f p r o t e i ne x t r a c t i o nb u f f e r a n do t h e r p a r a m e t e r s o np r o t e i n p a t t e r n w e r e d i s c u s s e d . K e y w o r d s:C a m e l l i aj a p o n i c a L e a f p r o t e i n s T w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s 2 0 0 8年第2期 生物技术通报 B I O T E C H N O L O G Y B U L L E T I N 研究报告 生物技术通报B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n2 0 0 8年第2期 1材料与方法 1 . 1试验材料 实验材料为3年生青岛居群山茶的扦插苗, 取叶片用于实验。 1 . 1 . 1设备与试剂试验设备:H i t a c h i S C R2 0 B C低温高速离心机( 日本,H i t a c h i) 、U V - 2 4 5 0紫外分光光度计 ( 日本,S h i m a d z u) 、A m e r s h a mB i o s c i e n c e公司的I P G p h o r T M等电聚焦系统、E t t a n T MD a l t 垂直板电泳系统和 灌胶模具。 试 验 试 剂 :p H 3 1 0和p H 4 7的 线 性I P G胶 条 ( 长1 8 c m) 、3 - (3 -胆 酰 胺 丙 基 )-二 乙 胺 -丙 磺 酸 (C H A P S) 、 苯甲基磺酰氟(P M S F) 、 乙二氨四乙酸(E D T A) 、 二硫苏糖醇(D T T) 、 尿素(U r e a) 、 碘代乙酰胺 (i d o a c e t a m i d e) 和矿物油( 购于A m e r s h a mB i o s c i e n c e s公司) 。 1 . 1 . 2溶液配方样品提取试剂:A)1 0 %三氯乙酸(T C A) 和1 0 m m o lL - 1D T T溶于丙酮中; B)丙酮( 用时 加入1 0 m m o lL - 1D T T ) 、1 m m o lL - 1P M S F和 2 m m o lL - 1E D T A ;C)9 0 %丙酮 ( 用时加入1 0 m m o lL - 1D T T ) 、 1 m m o lL - 1P M S F和 2 m m o lL - 1E D T A 。 全蛋白抽提液:8 m o lL - 1尿素、 4 %(W/ V)C H A P S、0 . 5 %I P G缓冲液 (p H 3 . 0 1 0或p H 4 7) 、2 0 m m o lL - 1 T r i s - b a s e(p H 8 . 5) 、1 0 m m o lL - 1D T T 、1 m m o lL - 1苯甲基磺酰氟( P M S F) 和2 m m o lL - 1E D T A , 溶于双蒸水。 可溶性蛋白提取液I:2 5 m m o lL - 1T r i s - H C l 、1 0 m m o lL - 1 K C l和2 0 m m o lL - 1M g C l 2; 可溶性蛋白提取液I I : 7 m o lL - 1尿素、 2 m o lL - 1硫脲( t h i o u r e a) 、4 % N P - 4 0、0 . 5 %两性电解质(p H 3 . 5 9 . 5) 和2 0 m m o lL - 1T r i s - H C l (p H 8 . 5) 。 肿胀液:8 m o lL - 1尿素、 2 %(W/ V)C H A P S和适量溴酚蓝 (b r o m o p h e n o l b l u e) ,双蒸水定容,使用前每 2 . 5 m l肿胀液加入7 m g D T T。 平衡液:1 . 5 m o lL - 1T r i s - H C l (p H 8 . 8) 、6 m o lL - 1尿素、 8 7 %甘油(V / V) 、2 %S D S(W/ V) 和适量溴酚蓝, 双 蒸水定容,- 2 0 保存。平衡液A: 使用前向平衡液中加1 %D T T; 平衡液B: 使用前向平衡液中加入2 . 5 %碘 代乙酰胺。 S D S凝胶缓冲液:1 . 5 m o lL - 1T r i s - H C l (p H 8 . 8) ,4 保存。S D S - P A G E电极缓冲液(p H 8 . 3) :2 5 m m o lL - 1 T r i s - b a s e、1 9 2 m m o lL - 1甘氨酸和 0 . 1 %(W/ V)S D S。 替换液:5 0 m l甘油、2 5 m l凝胶缓冲液和适量溴酚蓝, 双蒸水定容至1 0 0 m l。 考马斯亮蓝染色液:0 . 1 %考马斯亮蓝G - 2 5 0、2 5 %乙醇、8 %冰醋酸和6 7 %双蒸水。 脱色液:2 5 %乙醇、8 %乙酸和6 7 %双蒸水。 琼脂糖封胶液:1 0 0 m l S D S - P A G E电极缓冲液(p H 8 . 3) 和低熔点琼脂糖0 . 5 %, 加热溶解, 以2 m l为单位 分装, 室温保存。 银染试剂: 参见郭尧君(1 9 9 9) 的方法。 1 . 2实验方法 1 . 2 . 1蛋白质提取全蛋白质的提取: 取3年生扦插苗叶片用于实验,- 7 0 冻存。称量样品1 g( 鲜重) ; 加 入样品鲜重1 0 %的P V P(p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e, 聚乙烯吡咯烷酮) 于- 2 0 预冷研钵中将冷冻的样品研磨至粉 末状, 转移至预冷的1 0 m l离心管中, 加入鲜重样品1 0倍体积的溶液A悬浮, 于- 2 0 沉降1 h,4 、3 50 0 0 r / m i n离心1 5 m i n, 弃上清; 沉淀用鲜重样品1 0倍体积的溶液B重悬浮, 混匀于- 2 0 静置4 5 6 0 m i n,4 、 3 50 0 0 r / m i n离心1 5 m i n, 弃上清; 沉淀用鲜重样品1 0倍体积的溶液C重悬浮, 混匀于- 2 0 静置4 5 6 0 m i n, 4 、3 50 0 0 r / m i n离心1 5 m i n, 弃上清; 沉淀用鲜重样品1 0倍体积的溶液B重悬浮, 混匀于- 2 0 静置4 5 6 0 m i n,4 、3 50 0 0 r / m i n离心1 5 m i n, 弃上清。沉淀于真空干燥机中干燥, 约3 0 m i n( 以干燥程度为准, 时间越 短越好) ; 除尽有机溶剂; 按1 0 m g干粉末加2 0 0 l蛋白抽提液的比例, 将样品与蛋白抽提液充分混匀; 冰浴 超声1 0 m i n( 超声2 s、 间隔4 s) ,4 00 0 0 r / m i n离心3 0 m i n, 弃沉淀, 上清为所需的蛋白溶液; 用改良的B r a d f o r d 1 2 8 2 0 0 8年第2期 法测定蛋白溶液的浓度。 可溶性蛋白质的提取: 称量样品2 g( 鲜重) , 入预冷的研钵中研磨成粉末( 研磨时加少许P V P) , 转至已 有1 0 m l可溶性蛋白提取液I的5 0 m l离心管中。加入终浓度1 m m o lL - 1/ m i n S F和 1 m m o lL - 1E D T A混匀, 5 m i n后加入终浓度为1 0 m m o lL - 1D T T , 震荡摇匀, 于冰上放置3 0 m i n。4 、2 00 0 0 r / m i n离心3 0 m i n, 转上清 于另一离心管中( 测定上清体积) 。向管中加入6倍体积的1 0 %的T C A( 丙酮配制,0 . 0 0 7 %D T T) ,- 2 0 沉 淀2 3 h,4 、1 10 0 0 r / m i n离心3 0 m i n, 弃上清。沉淀用2倍体积( 第一次离心后上清体积) 丙酮( 含0 . 0 0 7 % D T T) 沉淀1 h,4 、1 10 0 0 r / m i n离心3 0 m i n, 弃上清。重复上一步骤2次。沉淀用2倍体积9 0 %丙酮洗, 沉淀 3 0m i n,4 、1 10 0 0 r / m i n离心3 0 m i n, 再重复一次。沉淀用2倍体积丙酮洗, 沉淀3 0 m i n,4 C、1 10 0 0 r / m i n离 心3 0 m i n。沉淀真空干燥约5 m i n, 除尽有机溶剂。按1 0 m g干粉末加1 0 0 l可溶性蛋白抽提液的比例, 加 入1 m m o lL - 1/ m i n S F 、2 m m o lL - 1E D T A和 1 0 m m o lL - 1D T T , 超声5 m i n, 充分溶解1 h,1 0 、4 00 0 0 r / m i n离心 1 5 m i n, 上清为所需的蛋白溶液; 用改良的B r a d f o r d法测定蛋白样品的蛋白浓度。蛋白样品溶液小量分装,- 8 0 保存。 1 . 2 . 2等电聚焦实验采用1 8 c m长的I P G胶条。考马斯亮兰染色法的蛋白质上样量为1 m g, 银染上样量 2 0 0 g和1 5 0 g。根据定量结果取适量的蛋白质, 加1 m o lL - 1 D T T到终浓度5 0 m m o lL - 1需要的体积, 补加 I P G缓冲液到终浓度0 . 2 %或者0 . 5 %的体积, 加R e h y d r a t i o n缓冲液到该胶条的上样体积3 5 0 l。充分混匀 1 0 、1 40 0 0 r / m i n离心5 m i n, 取上清液。取出胶条室温下平衡放置1 0 m i n, 沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右 线性加入样品,用镊子轻轻去除预制I P G胶条上的保护层。将I P G胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液 上, 除去胶面与样品液之间的气泡。缓慢的加入矿物油, 盖上胶条槽的盖子。先以无电压泡胀8 h, 然后以 5 0 V低电压泡胀4 h后进行等电聚焦。泡胀与聚焦参数见表1。 一般无电压泡胀与低电压5 0 V泡胀的时间加起来为1 2 h, 无电压泡胀能够使小分子蛋白进入胶内, 低 电压泡胀能够使大分子量蛋白容易进入胶内。 如果某些样品达不到设置的80 0 0 V / h, 以总伏小时数能够达 到设置值为等电聚焦完成标准。 1 . 2 . 3胶条平衡及S D S - P A G E拿出适量平 衡 液 融 化 平 分 到 平 衡 管 中 , 一 半 加 入1 % D T T, 一半加入2 . 5 %碘代乙酰胺, 充分溶解。 等电聚焦完成后,关掉电源,用镊子夹出胶 条, 胶面朝上放在湿润的滤纸上, 用另外一张 湿润的滤纸覆盖在胶面上,轻轻吸去上面的 油。使胶条支持膜紧贴平衡管壁放进含D T T 的 平 衡 液 中 进 行 还 原 , 低 速 摇 床 上 放 置 1 5 m i n, 把胶条取出来转入含碘代乙酰胺的平 衡管中, 烷基化打开的二硫键,低速摇床上放置1 5 m i n。 在灌胶模具上灌制1 2 %S D S分离胶凝胶, 水饱和正丁醇封胶, 凝胶聚合1 h以上, 凝胶要避免产生气 泡。 小心将已平衡好的第一向胶条放置在胶面上, 支持膜紧贴长玻板, 轻轻压紧, 胶条与胶面之间不要有气 泡, 胶条碱端加入分子量m a r k e r, 覆盖一层0 . 5 %琼脂糖固定胶条开始电泳, 示踪溴酚蓝迁移至距离凝胶底 边1 . 5 c m停止电泳。 1 . 2 . 4染色和脱色电泳结束后,p H 3 1 0的胶条采用采用考马斯亮蓝染色法染色。 染色6 h后脱色。p H 4 7的胶条采用银染法染色。胶图用U M A XP o w e r L o o k 2 1 0 0型扫描仪以3 0 0 d p i进行扫描。 2结果与分析 以全蛋白质提取方法, 分别以p H 3 1 0和p H 4 7的长1 8 c m的胶条进行实验。 表1 I E F参数(2 0 ,1 8 c m胶条, 每一胶条最大电流5 0 mA) 周蕴薇等: 山茶叶片可溶性蛋白双向电泳技术的建立 1 2 9 生物技术通报B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n2 0 0 8年第2期 采用p H 3 1 0的胶条电泳,1 m g蛋白质上样, 考马斯亮蓝染色并脱色后, 只得到约2 0个蛋白点。 而且蛋白质 点都集中在p H 4 7的范围内, 多为酸性蛋白, 碱性蛋白几乎没有( 图1) 。 根据p H 3 1 0的胶条的实验结果, 用p H 4 7的胶条电泳,2 0 0 g蛋白质上样, 银染方法染色后, 分离结 果明显改善, 得到蛋白质点近5 0 0个, 蛋白质点较均匀的分布于整个p H梯度内。但在p H 5附近有较深的 背景, 还有一部分蛋白没有分开( 图2) 。 采用可溶性蛋白质的提取方法,p H 4 7的胶条电泳,1 5 0 g蛋白质上样,银染方法染色,分离效果良 好, 而且背景很浅。得到近4 0 0个蛋白质点( 图3) 。 图1山茶叶片全蛋白质2 - D电 泳图谱 p H 3 1 0的I P G胶条,上样蛋白 量为1 m g, 凝胶浓度1 2 %, 考染 图2山茶叶片全蛋白质2 - D电 泳图谱 p H 4 7的I P G胶条, 上样蛋白量 为2 0 0 g, 凝胶浓度1 2 %, 银染 图3山 茶 叶 片 可 溶 性 蛋 白 质2 - D电泳图谱 p H 4 7的I P G胶条, 上样蛋白量 为1 5 0 g, 凝胶浓度1 2 %, 银染 3讨论 3 . 1蛋白沉降方法 T C A /丙酮沉降法是植物蛋白常用的一种提取方法, 该法能将样品中的大部分色素、 脂类、 核酸和盐等 除去, 并能抑制蛋白酶的活性, 特别是能浓缩特殊的碱性蛋白质, 如核糖体蛋白质, 但由于沉降后部分蛋白 质不能重新溶解从而导致丢失 3 。 山茶叶片中含有大量的酚类、 色素、 脂类和糖类等对等电聚焦有严重影响 的物质, 能否除去这些物质直接影响双向电泳效果。在山茶叶片全蛋白的提取过程中采用了T C A /丙酮沉 降法, 获得的双向电泳胶图在酸端p H 5处有一条纵向的条带难以去除( 图2) 。表明有可能存在影响电泳效 果的物质未能完全去除。 为了改善双向电泳体系, 提取了叶片的可溶性蛋白, 并采用了三氯甲烷沉淀法。 此 法在S D S - P A G E电泳中没能显示出清晰的条带。为进一步优化体系, 用T C A /丙酮沉降法提取可溶性蛋白, 去除了酸端的条带, 获得了较清晰的蛋白点( 图3) 。T C A不利于蛋白的抽提, 使用浓度不宜过高, 在后面的 丙酮处理中, 应尽量除去。另外, 在提取可溶性蛋白的过程中, 增加了丙酮清洗的次数, 对于去除杂质起到 了重要的作用。 3 . 2蛋白提取液组成 影响双向电泳分离效果的关键因素是蛋白样品的制备,除了蛋白沉淀方法直接决定双向电泳效果之 外, 蛋白提取液的组成也是决定双向电泳成功与否的重要因素。目前国内外常用的蛋白质提取液(9 m o lL - 1 尿素、2 % 4 %C H A P S、1 %D T T和2 %V / V载体两性电解质) 还是基于OF a r r e l l的尿素裂解液修改而成 4 。 由于蛋白质表达的动态变化很大, 并且不同蛋白质的分子量、 等电点和溶解性存在很大的差异, 细胞或组 织中蛋白的提取液组成应依据参考文献, 根据材料的种类、 取样部位及发育时期等进行适当调整。 蛋白提取液的主要成分应包括变性剂、 表面活性剂、 还原剂、 蛋白酶抑制剂和载体两性电解质几种重 要的组成成分。其中变性剂用于最大限度的增加蛋白的溶解性, 要求不能对等电聚焦和染色有影响, 即不 1 3 0 2 0 0 8年第2期 能带电荷。尿素是较理想的中性增溶剂, 它能很好的增加蛋白质的溶解度, 破坏蛋白质的高级结构, 另一种 增溶剂硫脲可以部分地替代尿素, 硫脲与尿素一起, 能增加疏水膜蛋白的溶解性, 获得更多的蛋白质点 5 ,6 , 一般是2 m o lL - 1的硫脲与 5 7 m o lL - 1尿素结合使用。2 m o l L - 1的硫脲尿与 7 m o lL - 1的尿素结合使用适合 山茶叶片可溶性蛋白质的提取。 蛋白质在去折叠后, 会暴露出大量的疏水性基团, 在蛋白提取液中需要至少1种表面活性剂来溶解疏 水基团。常用的有阴离子去污剂S D S, 非离子去污剂T r i t o nX - 1 0 0、N P - 4 0及两性离子去污剂C H A P S、A S B - 1 4、C 8和S B 3 - 1 0等。S D S可以有效地增加大多数蛋白质的溶解性并抑制蛋白酶的活性, 但不利于稳定等电 聚焦中蛋白质的等电点, 易导致聚焦失败。非离子型去污剂和两性离子去污剂能在不破坏蛋白质结构, 保 持生物活性的情况下改善蛋白质的溶解度 7 , 但是必须选择合适的浓度, 浓度太低不能改善蛋白质的溶解 性, 浓度太高会使蛋白带变宽, 影响分辨率和引起纹理现象。C H A P S是最近常用的两性离子去污剂 8 , 浓度 为2 % 5 %。在山茶全蛋白提取过程中应用了4 %(W/ V)C H A P S;可溶性蛋白提取的过程中, 应用了浓度为 4 %的N P - 4 0, 很好地提高了山茶叶片蛋白质的溶解性。 在变性剂和表面活性剂的作用条件下, 加入还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全, 溶解更彻底。一 般使用 -巯基乙醇、D T T和二硫赤藓糖醇(D T E) 等还原剂 9 ,D T T和D T E本身带有电荷, 在等电聚焦时会 迁移到p H范围以外, 从而使某些蛋白质的二硫键重新配对使溶解度降低而重新沉淀下来。非离子型还原 剂如三丁基膦(T B P)2 m m o lL - 1能增加蛋白质的溶解性 1 0 , 并可帮助蛋白质从第一向转移到第二向。采用 D T T作为还原剂。 蛋白酶抑制剂能够暂时或者永久性的破坏蛋白酶的活性, 减少蛋白质被降解和修饰的可能性。 常用的 蛋白酶抑制剂包括F M S F、E D T A、C o c k t a i l等 1 1 。P M S F可抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶,E D T A可抑制金 属蛋白酶。C o c k t a i l是多种蛋白酶抑制剂的混合物; 可溶性蛋白酶抑制剂F M S F和E D T A。 由于F M S F在水溶 液中半衰期很短, 而且遇D T T失效, 所以P M S F需新鲜加入, 充分混匀, 约5 m i n后加入D T T。 3 . 3其他技术环节 样品在冷冻条件下, 易破碎, 且蛋白不易降解。山茶叶片中色素、 酚类物质含量很高, 研磨应在液氮条 件下迅速进行, 并加入适量P V P, 充分研磨, 形成粉末后, 迅速移入蛋白提取液中, 以最大限度的去除酚类 物质的影响及有效的抑制蛋白酶的活性。 采用本研究的研磨与提取方法,1 g叶片约能提取3 m g蛋白质。 固 相I P G胶条, 具有p H梯度稳定、 重复性好、 分辨率高、 上样量大和操作简便等特点。本实验首先选用p H 3 1 0的宽范围I P G胶条做预试验, 实验结果显示, 只得到了5 0个蛋白质点, 蛋白点多集中于酸端, 之后改用 p H 4 7的I P G胶条, 蛋白质点达到4 0 0 5 0 0左右,2 - D图谱得到明显的改善。用于2 - D蛋白质检测的常用 方法是考马斯亮蓝染色法、 银染法和荧光染色法。考马斯亮蓝染色灵敏度较低, 检测限为0 . 2 0 . 5 g。银染 灵敏度很高, 检测限为0 . 1 n g。应用考马斯亮蓝染色法的上样量在1 m g, 获得了较清晰的蛋白质点。在全蛋 白的双向电泳实验中,1 8 c m固相胶条银染的上样量为2 0 0 g, 在可溶性蛋白的双向电泳实验中,1 8 c m固相 胶条银染的上样量为1 5 0 g。过高的上样量会使染色背景过深, 过低则得不到足够的蛋白质点。本实验采 用银染法得到的2 - D图谱背景比较清晰, 得到的蛋白质2 - D图谱很好。 可以利用图像分析软件对图谱间的 差异进一步做各种分析。 参 考 文 献 1郭尧君, 编著.蛋白质电泳实验技术 M .北京: 科学出版社,1 9 9 9,2 4 3 2 4 4 . 2 A c k e r m a n,WL . A m e r i c a nC a m e l l i a Y e a r b o o k,2 0 0 2,5 7:7 3 7 7 . 3 G o R GA,O B E R M A I E RC,B O G U T HG,e t a l . E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 7,1 8:3 2 8 3 3 7 . 4丁坤善, 郑彩霞, 包仁艳, 等.植物学通报,2 0 0 5,2 2(2) :1 9 0 1 9 7 . 5 P A S Q U A L I C,F I A L K A LI,H U B E RL A . E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 7,1 8(1 4) :2 5 7 8 2 5 8 1 . 6 R A B I L L O U DT . E l e c t r o p h o r e s i s,1 9 9 8,1 9:7 5 8 7 6 0 . 周蕴薇等: 山茶叶片可溶性蛋白双向电泳技术的建立 1 3 1 生物技术通报B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n2 0 0 8年第2期 图6小麦We I F 3 c与其它物种e I F 3 c 1氨基酸序列的系统树 3讨论 在2 0 0 3年,V a l a s e k,L等完成了酵母中各种蛋白翻译起始因子间的相互作用图。 这为研究各种蛋白间 的相互作用打下了基础 5 。但是目前在植物中对于e I F 3 c只有对拟南芥有一定的研究, 其它的植物很少有 涉及, 从g e n e b a n k中查找有关e I F 3 c的序列, 植物中只找到我们比对的几个序列, 除了拟南芥, 其它也都是 推测的e I F 3 c基因序列, 因此对于研究植物尤其是作物中的e I F 3 c还是很有必要的。 李竑等 3 在2 0 0 3年克隆了水稻的e I F 3 a大亚基的的编码基因, 这是国内首次涉及关于e I F 3基因的研 究。目前在小麦中克隆的蛋白翻译起始因子有e I F - 1 A 6 、 e I F - 2 7 、e I F 4 B 8 和e I F 5(g e n e b a n k序列号:E F 1 9 0 3 2 9) , 但是未见有其它翻译起始因子的报道。 而在国内尚未进行有关植物e I F 3 c基因的研究, 而且有关小麦中真核蛋 白翻译