溶氧对Blakesleatrispora分批发酵生产β-胡萝卜素的影响.pdf

3 2 微 生物 学杂 志 2 0 0 9 年 1 1 月第2 9 卷 第6期 J O U R N A L O F M I C R O B I O L O G Y N o v 2 0 0 9 V o 1 2 9 N o 6 溶氧对 B la k e s l e a t r i s p o r a分批发酵生产 I3 ；一 胡萝 卜素的影响 张 宁 ，虞 龙 ( 1 中国林 业科学研究 院林产化学工业研究 所 国家林 业局 林产化学工程莺点开 放性实验室 ， 江苏 南京2 1 0 0 4 2 ； 2 南京工业大学 ， 江苏 南京2 1 0 0 4 2 ) 摘 要 在摇瓶和 5 L发酵罐 中研 究 了溶氧 ( D O)对 B l a k e s l e a t r i s p o r a分批发酵生产 p 一 胡萝 卜素的影响， 总结 了 5 L发酵罐 中 p 一 胡萝 卜 素发酵过程 中溶氧的 变化规律。结果表明 ， 当5 0 0 m L摇瓶装液 量为 5 0 mL ， 转速为 2 4 0 r ra i n 条件 下发 酵生产 B 一 胡萝 素产量最 大， 达到 3 4 1 6 g L ； 5 L发 酵罐 中， 在搅 拌转速 为 l 0 0 0 r ra i n ， 通 气量为 1 5 v v m 的条件 下， B 一 胡萝 素的产量可达到 3 7 1 2 g L， 略 高于摇瓶 ， 这 可能是 由于5 L发酵罐 中的气 液传递和混合状况好 于摇瓶 ， 促进 了产物的合 成。 关键词B - 胡萝 卜 素 ； 溶氧 ； 分批发酵 中图分类号T Q 9 2 2 文献标识码A 文章编号1 0 0 5 7 0 2 1 ( 2 0 0 9 ) 0 60 0 3 2 0 4 Ef f e c t o f Di s s o l v e d Ox y g e n o n Ba t c h Fe r m e nt a t i o n t o P r o d u c e B c a r o t e n e b y B l a k e s l e a t r i s p o r a ZHANG Ni n g YU L o n g ( 1 I n s t o fC h e m1 n d o fF o r e s t P r o d ，C A F， K e y O p e n L a b O n F o r e s t C h e m E n g i n ， S F A； 2 N a n n g U n i v of T e c h n o 1 N a n 社 n g 2 1 0 0 4 2 、 Ab s t r a c t T h e e f f e c t o f d i s s o l v e d o x y g e n( D O)o n f 3 - c a r o t e n e b a t c h f e r me n t a t i o n b y Bl a k e s l e a t r i s p o r a i n s h a k e fl a s k s a n d 5 l i t e r s s t i r r e d f e r me u t o r we r e i n v e s t i g a t e d a n d t h e f e r me n t a t i o n l a ws o f B c a r o t e n e i n 5 l i t e r s s t i r r e d f e r me n t o r we r e c o nc l u de d I t wa s s ho wn t h a t wi t h t h e c u l t u r e v o l u me o f 5 0 mL i n 5 0 0 mL s ha ke fla s ks a n d a 24 0 r pm s ha ki ng s p e e d， t h e y i e l d o f- c a r o t e ne wa s 3 41 6 g LI n 5 l i t e r s s t i r r e d f e r me nt o r ，un d e r t h e c o n d i t i o n o f 1 0 0 0 r p m a g i t a t i o n s p e e d s a n d 1 5 v v m a e r a t i o n r a t e， t h e y i e l d o f B c a r o t e n e w a s 3 7 1 2 g L， a n d wa s h i g h e r t h a n i n s h a k e r fla s k s T h i s ma y b e du e t o t h e c o n di t i o n s o f g a s l i qu i d t r a n s f e r r i n g a n d mi xi n g i n 5 l i t e r s s t i r r e d f e r me n t o r we r e be t t e r t h a n i n s h a k e r fl a s k s ，a n d p r o mo t e d t h e s y n t h e s i s o f p c a r o t e n e Ke y wo r d s B- c a r o t e n e ；d i s s o l v e d o x y g e n； f e d b a t c h f e r me n t a t i o n 以 B 胡萝 卜素为代 表的类 胡萝 卜素是一类 呈现黄色 、 橙红色或 红色的 多烯类 化合物， 在食 品 、 化妆 品 以及 保健 品 方 面具 有 广 泛 的用 途 。 自 1 9 8 1年 D o l l 等 对 类 胡 萝 卜 素 与 肿 瘤 抑 制 的 相关 性 作 了系统论 述 以 来 ， 重 新 引起 了人 们 对类 胡 萝 卜素的重视， 尤其是对 B 一 胡萝 卜 素作为维生素 A 原 之外 的新 的生 物 学 特 性 的关 注 。 特 别是 2 O 世纪 9 0年代以来 ， 有关专家对其作用机制在流行 病 学 、 保健 预防 疾 病 的 作 用方 面 进 行 了 广泛 和深 入 的研 究探 讨 ， 并 取 得 了相 当 大 的 成果 。大 量 的 研究 证 实 ， 类胡 萝 卜 素在 减少癌 症 的 发生 和发 展 、 减少心血管疾病发病率、 增强免疫功能和视觉保 护 等方 面具有 独特 的生理 功 能。 天然 类胡 萝 卜 素 的生产方法 主要有 3大类 ： 从 天然 植物 中提 取 ； 大面积养殖盐藻获得 ； 通过微生物 发酵生产 。与其他生产方法相 比， 发酵法生产 类胡萝 卜素工艺具有安全、 成本低、 着色力强等优 势 ， 在 国内外受到格外关注 ， 其中利用异宗配合菌 作者简介 ： 张宁女 ， 在读博 士后 研究方向为 I k 微生物 E m a i l - l 1 i “ g z h a n g e m a i l 1 2 6 t o n i 收稿 FJ 期 ： 2 0 0 9 - 0 4 1 4 ； 修 回 日期： 2 0 0 9 -08 2 4 6期 张宁等 ： 溶 氧对 B l a k e s l e l t r i s p o r a分批发酵生 产 8 一 胡萝 l、 素 的影 响 三孢 布 拉 霉 ( B l a k e s l e a t r i s p o r a ) 混 合 发 酵 生 产 $ 胡 萝 I 、 素 是 比较 理 想 的 产 业 化 方 法 。曰 i s p o r a 发酵生产 B 一 胡萝 卜 素的过程为需氧过程 ， 该体系 发酵液 粘度较高 ， 氧传递 系数 较低 ， 易导致溶 氧 ( D O) 不 足 ， 而 成 为 发 酵 的 限 制 因素 ， 避 免 这 种 限 制 常 常是发 酵 成 功 的关 键 。本 文 首先 利用 摇 瓶研 究 了不 同装 液 量 和 搅 拌 转 速 对 B 胡 萝 卜素 发 酵 的影 响 ， 进 而用 5 L发 酵 罐 探 讨 了通 气 量 和 搅 拌 转速这两个最重 要 因素对溶氧 以及 8 胡 萝 卜素 发 酵 的影 响 。 1 材料 与方法 1 1 材 料 1 1 1 菌种 异 宗 配 合 菌 f r 却o r a(+) 、 B t r i s p o r a (一) ， 实 验室 筛选 保 藏 。 1 1 2培养基 ( g L ) 固体培养基 ： 玉米粉 3 0， 麦 芽浸粉 1 O ， 琼 脂 粉 1 5 ； 种子 培 养 基 ： 玉米 粉 4 0， 黄 豆粉 2 0 ， 磷 酸 二 氢 钾 2 ， 硫 酸 镁 0 5； 发 酵 培 养 基 ： 玉米 粉 2 O， 黄豆 粉 4 O ， 玉 米 油 3 0 ， 磷 酸 二 氢 钾 2 ， 硫 酸镁 0 5， 维生 素 B 0 0 0 2 。 1 1 3主 要 仪 器设 备 摇 床 ： S P Y 5 0型 双 层 培 养摇 床 ， 上海 市离 心 机 械 研究 所 ； 5 L发 酵 罐 ： K F 一 5 L型 自控 通 气 搅 拌 罐 ， 韩 国高 佰 特 公 司 ， 总 体 积 为 5 L ， 工作 体 积 为 3 L， 温度 、 p H、 搅 拌 转速 、 相 对 溶解 氧 等参数 可 显 示 及 控 制 ， 消 泡 剂 可 由蠕 动 泵 流加 。 1 2 方 法 1 2 1 摇床发 酵摇床转速对发酵的影响 ： 在 5 0 0 m L摇 瓶 中装 入 5 0 mL的发 酵培 养 基 ， 将 培 养 好的正、 负菌种子液以 1 0 ( 体积分率 ) 的接种量 接种 到发 酵培 养基 中 ， 正 负 菌 的接种 比例 为1： 1 5 ( 体积 比) ， 发 酵温 度 为 2 8 ， 在 不 同转 速条 件 下 ( 1 8 0 、 2 0 0 、 2 2 0 、 2 4 0 、 2 6 0 r m i n ) 震 荡 培 养 9 6 h ； 装 液 量对 发酵 的影 响 ： 在 同 一 摇 床 上 采用 相 同 规 格 的摇瓶 ( 5 0 0 m L ) 进 行 发酵 实 验 ， 5 0 0 mL摇 瓶 中 的装 液量 分别 为 2 5 、 5 0 、 1 0 0和 1 5 0 m L 。 1 2 2 分析 方法生物量的测定 ： 将发酵液转 入 离 心杯 中 ， 以 5 0 0 0 r mi n离 心 1 0 mi n ， 弃 去 上 清液 ， 沉淀 水 洗后再 次 离 心 ， 所 得 菌 体 于 4 5 真 空 干燥 后 称质 量 ； B 胡 萝 卜素含 量 的测 定 ： 用 高 效液相色谱 测定 发酵 液 中的 8 胡萝 卜素。流动 相 为甲醇四氢 呋 喃 水 ( 7 0 ： 2 6：4)， 检 测 波 长 为 4 7 2 n m， 流 速 为 1 5 m L m i n ， 3 - 胡 萝 卜素 的 出 峰时 间 为 1 21 3 mi n 。 2 结果 与分析 2 1 摇床 转 速对 发酵 的 影响 摇床 转 速对 发酵 影 响 的实验 结果 ( 见 图 1 ) 表 明 ， 在 转 速 为 2 4 0 r m i n条 件 下 发 酵 生 产 8 胡 萝 卜 素产量最大， 达到 3 3 9 5 g L 。实验发现 ， 摇床 转 速 为 2 4 0 r m i n时 ， 菌 丝 体 形 成 一 定 大 小 的球 形 ， 细胞颗粒 内部结构松散 ， 颗粒整体活性好 ， 发 酵效率较高 ； 摇床转速达到 2 6 0 r m i n时 ， 菌丝体 亦 成球 形 ， 但 直径 小 ， 数量 多 ， 且 质 地 紧密 ， 导致 菌 丝体不能与发酵液充分混合 ， 降低 了发酵效率。 摇床 转 速 ( rII1 i n ) 图 1 转速对发酵 B - 胡萝 卜素 的影响 F i g 1 T h e e f f e c t o f s h a k i n g s p e e d o n B c a r o t e n e f e r me n t a t i o n 2 2装 液 量对 发酵 的 影响 由装液 量 对发 酵影 响 的实 验结 果 ( 见 图 2 ) 可 知 ， 在 固定 了摇 床转 速 的条 件下 ， 对 相 同规 格 的摇 瓶 而 言 ， 摇 瓶装 液量 对 B 一 胡 萝 卜素发 酵 的影 响 显 著 。 当摇瓶 装 液量 增 加 到 5 0 m L时 ， 菌 体 与 发 酵 培 养基 混合 充 分 ， B 一 胡萝 卜 素 的 产量 大 幅度 增加 ， 可 达 到 3 4 1 6 g L； 而 当装 液量 达 到 1 0 0 m L时 ， 菌 体浓度达到最大 6 5 6 g L ， 而后下 降。这也表明 与菌体 的生 长 相 比， B 一 胡 萝 卜素 的合 成 易于 在 “ 富 氧 ”状 态 下 进 行 ， 需 要 为 此 提 供 高 溶 氧 的 环境 。 2 3 5 L发酵罐溶氧对发酵 B - 胡萝 卜素的影响 2 3 1 不 同搅拌 转 速 和 通 气 量 对发 酵 B 胡 萝 卜 素 的影 响 在 5 L发 酵 罐 中 发 酵 B 一 胡 萝 卜素 ， 在 搅拌 转 速分 别 为 5 0 0 、 1 0 0 0和 1 2 0 0 r m i n ， 通 气 量分别为 0 5 v v m、 1 0 v v m和 1 5 v v m时， 发酵过 【 1 _ ， 1 蛏 惴 L 。 4 2 O 8 6 4 2 3 3 3 2 2 2 2 6 5 5 4 4 3 3 2 2 _ 1 粗 3 4 微生物学杂志 2 9卷 程菌体浓度、 8 一 胡萝 卜素产量及相对溶氧的变化 如 图 3所示 。 7O 6 0 50 4O 髓3O 20 2 5 5 O 7 5 1 0 0 l2 5 1 50 发酵 液 体积( Il l I 5 0 0 Il l L ) 2 0O 圄 2 摇瓶装液量对发酵 B - 胡萝 卜素的影响 一 、 蠼 髅 上 抵 f Fi g 2 T h e e f f e c t o f f e r me n t v o l u me o n p- c a r o t e n e f e r me n t a t i o n 。 。 。 三 0 。 H - - 0 世 。 捆 图 3 转速和通气量对菌体浓度和 I 1 胡 萝 卜素 产 量 的 影 响 F i g 3 T h e e ff e c t o f a e r a t i o n r a t e a n d a g i t a t i o n s p e e d o n my c e l i u m a n d B c a r o t e n e c o n c e n t r a t i o n 图 3表 明 ， 在 转 速 为 5 0 0 r rai n的 条件 下 ， 菌 体浓 度及 B - 胡 萝 卜素 产 量 虽 均 随 着 通 气 量 的 加 大 而有所增加 ， 但 菌体浓 度均 明显 偏低 ， 总体 发酵 水 平不 高 ， 通气 量增 加 到 1 5 v v m 时 ， 发 酵 7 d 6 一 胡萝 卜素产 量 达 到最 高 1 0 2 0 g L ； 在 转速 为 1 0 0 0 r m i n的 条 件 下 ， 菌 体 浓 度 、 B - 胡 萝 卜素 产 量及产率均随着通气量的加大而明显增加 ， 通气 量增加到 1 5 v v m时， 发 酵至第 4天菌体浓度和 B 一 胡 萝 卜素 产 量就 增 加 到 最大 值 ( 5 7 2 g L 、 3 7 l 2 g L ) 。说明此时的通气条件可以使发酵液 中各组分混合均匀 ， 较适合菌体的生长和 B - 胡萝 卜 素的合成 ； 当把搅 拌转速 提高 到 1 2 0 0 r rai n 时 ， B 一 胡萝 卜 素的产量在通气量为 1 0 v v m与 1 5 v v m时显著减少 ， 这可能是 由于进一步增加搅拌 转速和通气量提高了发酵液中的氧浓度 ， 氧化 了 部分产物 B 胡萝 卜 素 的缘故。 2 3 2 5 L发酵罐发 酵 B 胡萝 卜素过程 分析 在最佳通气量、 最佳搅拌转速条件下整个发酵过 程中的溶氧、 菌体生物量、 残糖和 B - 胡萝 卜素产 量 等的 变化 如图 4所示 。 图 4 5 L发酵罐发酵过程分析 Fig 4 F e r me n t a t i o n c u r v e o f 5 L f e r me n t o r eo 3 0 三 。 薏 由图 4可 以明显看出 ， B 一 胡萝 卜素的合成与 B t r i s p o r a的生长 部分相关 ， 发酵 的第 02 4小 时 为 B t r i s p o r a生长迟滞期 ， 菌体数量增加迟缓， 几 乎没有产物 B 胡萝 卜 素 的积累， 菌体呼吸耗氧较 少 ， 溶 氧处 在 较 高水 平 ； 发 酵的第 2 4 7 2小 时 为 菌体生长的指数生长期 ， 菌体生长需氧急剧增加 ， 此时菌体合成 8 一 胡萝 卜素的速率逐渐上升， 需氧 量也随之增加 ， 这两者 的共同作用 导致发酵液溶 氧水平迅速下降， 第 7 2小时时发酵液中的溶氧下 降至最 低 ， 只 有 初 始 饱 和 溶 氧 的 2 0 7 ； 发 酵 至 第 7 2小 时 以后 菌体 生 长速率显 著降 低 ， 耗 氧量 也 迅 速下 降 ， 但 此 时菌体 合成 B 一 胡 萝 卜 素 的 速率 急 剧上升 ， 其对氧的需求量大大增加， 它使发酵液 中 I I d 一 J 嚣 ) 雠蛏 懈L l l挚 n 6期 张宁等 ： 溶 氧对 B l a k e s l e a t r i s p o r a分批 发酵生产 B 一 胡 萝 b素的影 响 3 5 的相对 溶 解 氧 仍 维 持 在 一 个 很 低 水 平 ( 2 1 2 2 ) ， 显 然相 对 于菌 体生 长 ， 菌 体 合 成 B 一 胡 萝 b 素 是 一个 耗 氧 速 率 更 高 的 过 程 。 直 到 发 酵 末 期 ( 第 9 6小 时 以后 ) ， 菌 体 合 成 了 B 一 胡 萝 b素 的 速 率有所下降 ， 溶解氧才开始 回升。 3 结 论 实验 结果 表 明 ， 溶 氧 是 B 一 胡 萝 卜素发 酵 过 程 中需 要重 点研究 的 一项 调 控 技 术 ， 发 酵过 程 中 氧 的供应是影响发 酵生产效 率的重要因素 ， 其供 给 水平会直接影 响到菌体 的生长和 B 胡萝 b素的 合 成 。与 菌体 生 长 相 比， B 一 胡 萝 卜素 的合 成 更 易 于在 “ 富 氧 ” 状 态 下 进 行 ， 其 中较 高 的 搅 拌 转 速 ( 1 0 0 0 r mi n ) 和 大通气 量 ( 1 5 v v m) 有 助于 提 高 B 胡萝 卜 素 的产 量 。 发酵液 D O水平 的高低取决于通气量、 搅拌 转 速 、 发 酵操 作 、 培 养 液 的理 化 性 质 、 发 酵罐 的几 何结构等因素 ， 是这些 因素 的综合结 果。D O参 数 能直 观 、 概 括地 反 映 B 一 胡 萝 卜 素 发 酵过 程 中氧 供 需之 间 的关 系 ， 并 用 来 衡 量 发 酵 过 程 是 否 正 常 进行 的综 合 指标 。可 以根 据 5 L发酵罐 发 酵 B 一 胡 萝 卜 素 过 程 中 D O的 变 化 规 律 ， 摸 索 进 一 步 放 大 发 酵 体系 的工 艺条 件 。 参 考 文献 王君 ，张宝善微生物生产天然色素的研究进展 J 微生 物学通报 ， 2 0 0 7 ， 3 4 ( 3 ) ：5 8 0 5 8 3 吴翠栓 ，黄晶晶 ， 艾秀丽 ， 等B - 胡 萝 素 的研究进展 J 中国 医院药学杂志 ， 2 0 0 8 ， 2 8 ( 1 6 ) ：1 3 8 1 1 3 8 3 刘红涛 ，冯书营 ，陈涛 ， 等 杜氏盐藻分子生物学最新进展 及展望 J 中国生物工程杂志 ， 2 0 0 7 ，2 7 ( 1 0 ) ：1 1 3 1 1 8 陈明伟 ，盐藻 B 一 胡萝 b 素合 成基 因 P S Y c D N A的分离 与 鉴定 J 现 代 中西 医结 合 杂 志 ，2 0 0 8，1 7( 1 5) ：2 2 9 4 2 2 9 6 李福枝 ，刘飞 ，曾晓 希 ， 等天 然类 胡萝 素 的研究 进展 J 食品工业科技 ， 2 0 0 7， 2 8 ( 9 ) ： 2 2 7 2 3 2 王永强 ，韩春然三孢布拉霉生产 番茄红 素发酵条件的研 究 J 食品研究与开发 ， 2 0 0 7， 2 8 ( 4 ) ： 5 4 - 5 7 卢红梅 ，梁逸 曾高效液相色谱法测 定食物中的类胡萝 素 J 色谱 ， 2 0 0 5， 2 3 ( 1 ) ： 5 7 - 6 2 孙健 ， 彭宏祥 ，董新红 ， 等甘薯中 B - 胡 萝 b 素 HP L C测定 方法分析 J 食品科技 ， 2 0 0 9， 3 4( 1 )： 2 3 6 2 3 9 F Ma n t z o u r i d o u，T Ro u k a s ， B Ac h a t z Ef f e c t