实时PCR分析△^5脱饱和酶在花生四烯酸合成中的作用.pdf

中国生物工程杂志C h i n a B i o t e c h n o l o g y ， 2 0 0 6 ， 2 6 ( 8 ) ： 5 7 6 l 实时 P C R分析 5脱 饱和酶在 花生 四烯酸合成 中的作用 肖 靓 刘 智 朱 敏 余龙江 朱 路 周 蓬蓬 ( 华中科技大学生命科学与技术学院武汉4 3 0 0 7 4 ) 摘要花生四烯酸是人体的必需脂肪酸， 具有独特的生物活性。 5 脱饱和酶是花生四烯酸生物 合成途径 中催4 -= - 高一 y 一 亚麻 酸脱饱和为花 生四烯酸 的酶 。通过 实时定量 P C R技术 ， 检测 了 脱饱和酶在不 同花 生四烯 酸产量 的 高山被 孢霉 ( Mo r t i e r e l l a a l p i n a ) 菌株 M1 0 、 M 6和 M 2 3中的 m R N A表达水平， 以及在高产花生四烯酸菌株 M 6培养过程中的 m R N A表达水平的动态变化。 发 现 脱饱和酶基 因的 mR N A表达水平与花生四烯酸的产生之 间存在 明显的线性关 系， 表 明 脱饱和酶在 高山被孢霉花生四烯酸合成途径 中起到 了非常重要 的作用。 关键词 5 脱饱和酶花生四烯酸实时 P C R高山被孢霉 中图分类号 ： Q 7 8 1 多 不 饱 和 脂 肪 酸 ( p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ， P U F A s ) 主要包 括 一亚麻 酸 ( G L A) 、 二 高一 一 亚 麻 酸 ( D G L A ) 、 花生 四烯 酸 ( A A) 、 二 十碳五烯酸 ( E P A) 、 二 十二碳六烯酸( D H A) 等 。P U F A s 的生物合成是 以饱和 脂肪酸一硬脂酸为底 物 ， 经碳链 延长 和脱饱 和两 个主 要反应而来 ( 图 1 ) 。 在 哺乳动物细胞 中， 只能在 9 位脱饱 和， 得 到油 酸， 多不饱和脂肪酸不 能合成 ， 必须 从食物 中摄取亚油 酸、 亚麻酸、 花生 四烯 酸 ( 这 三种脂肪 酸被称 为必需脂 肪酸 ) 。花生 四烯 酸是人体 最重要 、 含量 最丰 富的 C P U F A， 它主要存在于器官、 肌 肉和血液组 织 中， 与磷脂 结合成结构脂类起着 重要作用。花生 四烯酸还是许 多 二十烯酸衍生物 的直接前 体 ， 如前列 腺素 E ( P E G 2 ) 、 前列环素 ( P G I ) 、 血栓素 A ( T x A ) 和 白三烯 等。近十 年的研究发现 ， 花 生四烯酸还 可 以通过 直接 或间接 的 途径调节多种器 官或组织 的各种离 子通道 ， 从 而对 心 脏 、 脑 、 平 滑 肌 等 起 调 节 作 用 。高 山 被 孢 霉 ( Mo r t i e r e U a a l p i n a ) 是一种 丝状真 菌 ， 它在 以碳水化 合 物为碳源 的培养 基 中生长 时 ， 菌体 内会 积 累较多 的油 脂 ， 其油脂 的脂肪 酸组成 中含有丰 富的多不 饱和脂 肪 酸 ， 尤其是 A A含量较 高 ， 被认 为是最好 的生产 A A 的 收稿 日期 ： 2 0 0 6 - 0 3 1 4 修 回日期 ： 2 0 0 6 -0 5 - 2 4 通讯作者 ， 电子信箱 ： y u l j m a i l h u s t e d u c n 菌种 。B o t h a等 发 现低 温 培养 法可 以分 离 高产 A A 的被孢霉菌株 ； Z h u 等 利用 T r c ( 红 四氮唑 ) 能被 还原性物质还原生成红色的 T F的原理 ， 发现 T I C染 色 深浅与被孢霉 中 A A含量呈正相关 的关 系 ， 并利用 T r c 染色法筛选 出了高产 A A菌株 M 6 ， 这些都 暗示 A A的 高产与脱饱 和反应有很 大的关系 。 脱饱 和酶是 催 化 A A形成的最后一步脱饱和反应 的酶 ， 我们在前期研 究 中从高产 A A菌株高 山被孢霉 M 6中克隆 了该 基因 完整 的 c D N A， 并且首 次在 巴斯德 毕赤酵母 中表达 J 。 现通过实时定 量 P C R技术 ， 研 究在不 同 A A产量 的高 山被孢霉以及高产 菌株 M 6的不 同 A A生产 阶段 ， 脱饱和酶基因的转录表达水平 ， 评价该酶在 A A生物合 成中的作用 ， 为进一步利用代谢工程构建高产 A A菌株 的研究打下基础。 1 材料 与方法 1 1菌株 高山被孢霉( 胍) 池 a l p i n a ) M 6 、 MI O 、 M 2 3为本 实验室从土壤 中筛选 。其中 MI O经 中国工业微生物菌 种保藏 中心 鉴定 为 高 山 被 孢 霉 ( 池 a lp i n a ) 。 M 2 3经 荷 兰 C B S鉴 定 为 高 山 被 孢 霉 ( 池 a l p i n a ) ， A A高产菌种 M 6经本实验室鉴定为高 山被孢 霉 ( M o r t i e r e U a a lp i n a ) ， 这 3株 菌 中 A A含量 分别 为 维普资讯 5 8 中国生物工程杂志 C h i n a B i o t e c h n o l o g y V o 1 2 6 N o 8 2 0 0 6 、 、， c0 0H ： ， c a r 1 I l G e 、 = ，、 、 入 八 八 、 = ， 、 = ，、 c= 卜 人 1I l ， 、 、 c 0 o 1- ： ： ， C O O H = = 、v C O O H ： ， = = C O O H ， 、， 、： ， ， ! ， ，、 炙 ， 导 ， 、 、 、 ， c 0 删 八、C O O H C O O H ： = ： ， ， C O O H 一 ： 、 、： 图 1 多不饱 和脂 肪酸的生物合成途 径 A 9，A 1 2， A 6， 5 ： 脱饱 和酶 ； E L： 延长酶 Fi g 1 Bi o s y n t h e t i c p a t h wa y f o r p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s 1 2 培养方法 菌种 于 P D A斜 面保存 ， 每 3个月转接 1次 。P D A 培养基 ： 葡 萄 糖 2 0 ； 马 铃 薯 浸 出液 2 0 0 ； 琼 脂 1 8 ； 自然 p H。生 产 A A 采 用 液 体 发 酵 培 养 基 ( g L ) ： 葡 萄 糖 5 0 ； 酵母 膏 5 ； 硝 酸 钠 3 ； K 2 H P O 3 H 2 O 1 ； M g S O 4 7 H 2 O 0 5 ； p H 6 5 。1 0 接 种量接 人 种子 ， 1 5 0 r ra i n ， 2 5 培养 1 0 d 。 1 3 从检测 A A标准 品购 自美 国 S I G MA公 司， 其它试剂 为市 售分析纯或生化试剂。气相色谱法检测， 气相色谱仪 为浙江福立分析 仪器 厂 9 7 9 0型 、 F F A P毛细管 色谱柱 购 自武汉大学化学系化工研究所 。提取和检测方法参 见文献 9 。 1 4 基 因克隆 1 4 1 5 脱饱和酶基 因克 隆根据 已发表 的高 山被 孢霉的 脱饱 和酶基 因序列 ， 设计引物 ： D 5 F ： 5 TI -I - I TA CGGTTA AGCAAGATG- 3 ； D5R： 5 一 GCGC I TI T T I T C T r C T A C T C T F C C T - 3 。按照 T a k a r a 反转 录试 剂盒 说 明书进行 R T P C R 。以总 R N A为模板 ， O l i g o d T为引 物先合成 c D N A第一链 ， 然后 以 I ) S F I ) S R为引物进行 P C R， 条件为 8 5 o C 5 m i n ； 然后 8 5 l m i n ， 5 0 1 r a i n ， 7 2 c 【 = 2 m i n 共 3 0个循环 ； 最后 7 2 C 1 0 m i n 。总 R N A提取参考 文献 1 1 。 1 4 2 高 山被 孢 霉 1 8 S r D N A基 因克 隆 采用 真菌 1 8 s r D N A扩增通用引物 ， F l ： 5 G A T C C T G C C A G T A GTC I lAT GC- 3 ；I T S 2： 5 - GC I lGC G-I I Tr CATC GAT GC- 3 。以总 D N A为模板 ， 进行 P C R ， 条件为 9 5 o C 3 m i n ； 然 后 9 4 l mi n ， 5 0 1 r a i n， 7 2 l mi n共 4 0个循环 ； 最后 7 2 1 0 m i n 。D N A提取采用 C r A B S D S法 J 。 目的片段通过 T A克隆 ( P r o m e g a ) 后 ， 获得含有 目 的基因的质粒 p D 5和 p l S S ， 提交上海 申友公司测序。 1 5定量 P CR 1 5 1 引物设计 和反 应条 件 采 用 S Y B R G R E E N I 方法实时检测 ， 脱饱和酶基 因的表达水平 。采用 1 8 S r R N A作为外参。根据测序得到 的的 脱饱和酶基 因 和 1 8 S r D N A基因序列 ， 采用 P r i m e r P r e m i e r 5软件设计 特异性引物。 5 脱饱和酶基因定量 P C R引物 ， A R T 1 ： 5 CGT ATCAAGCCC AACCAA- 3 ； A RT 2： 5 G GG A AC A A T C AA GC GG T A一 3 。 1 8 S r DN A 基 因 定 量 P C R 引 物 ， 1 8 S R T 1 ： 5 一 G C C T I G T G C T G G C G A T G T - 3 ； 1 8 SR T 2： 5 一 C1 GCC TF CC T TGGA r G1 GGT一 3 。 仪器为 R O T O R G E N E 3 0 0 0荧光实时定量 P C R仪， 定量 P C R 条 件 ： 9 5 o C 5 m i n ； 9 4 2 5 s ， 4 8 2 5 s ， 7 2 2 5 s ， 4 0个循环 。定量 P C R反应体系为 2 0 1x l 。 1 5 2 目的基 因含 量标准 曲线取含 目标基 因片段 的质粒( p D 5和 p i S S ) ， 纯 化后 ， 紫外定量 ， 稀释起始浓 度为 1 n m o l L 。然后 1 0倍 梯度稀 释 目标质粒 ， 用作标 准曲线制备 的模板 。采用 s y b r G r e e n I 染料监测 P C R反 应过程 ， 标准品及样 品在 同一反应体系 中进 行， 重复 3 管 ， 保证标准曲线 的 R值在 0 9 8以上。 维普资讯 2 0 0 6 ， 2 6 ( 8 ) 肖靓 等： 实时P C R分析s 脱饱和酶在花生四烯酸合成中的作用 5 9 1 5 3 基 因表达检 测 ，选取 M1 0 ， M 2 3， M 6三种不 同 A A产量的高山被孢霉的第 6 d培养物 以及 M 6的第 3 d 、 6 d和 9 d培养物进行总 R N A提取， 分别采用 O l i g o d T 9引 物和随 机 引物 反 转 录， 制 备 D N A。随 机 引 物 制 备 的 c D N A片段稀释 1 0 0倍后用 作外标 1 8 S r D N A定量 的模 板， O l i g o d T 9引物制备的 c D N A片段用作 脱饱和酶基 因定量的模板。 5 脱饱和酶基 因的表达水平用 脱饱 和酶基因相对 1 8 S r D N A的表达量来衡量。 2结果 与分 析 2 1 三 株 高 山 被孢 霉 中 脱 饱 和 酶 基 因克 隆 及 1 8 S r D N A基因克隆 采用 R T P C R技术 ， 分别从 3株不 同 A A产量 的高 山被孢霉 M1 0 ， M 6和 M 2 3中扩增 5 脱饱和酶基因 ， 结 果如图 2所示 。表明能够从 3种不 同的菌株 中克隆到 大小相同的特异性片段 ， 但亮度存在 明显 的差别 ， 表现 为 M1 0 M 2 3M 6 。3种 菌株在发 酵培养 基 中培 养 6 9 d 后 ， 干菌体生物量为2 0 g L左右， 油脂含量为3 7 3 8 ， 但油脂 中 A A含量差别很 大 ， M 1 0 ( 8 2 0 ) M 2 3 ( 3 5 一 5 0 ) M 6 ( 5 0 7 2 ) 。图 2 结果 暗 示 脱饱 和酶基 因在不 同菌株 中的表达水平 可能决 定着 A A的产量。 图2 高山被孢霉 M1 0 、 M6 、 l v l 2 3中 5 脱饱和 酶基因的RT P CR克隆 1 ： DL 2 0 0 0 Ma r k e r ； 2： M 1 0； 3： M6； 4： M2 3 F 嚷 2 Mo l e c u l a r c l o n i n g o f g e n e e n c o d i n g - f a t t y a c i d d e s a t ar a s e f r o m M o r t i e r e U a a l p i n a s t r a i n s M 1 0， lv l 2 3 a n d M6 b y R T - P C R 来源于 3株不 同高 山被孢霉菌 株 的 5 脱饱和酶 基因经过 T A克隆后 ， 提交上海 申友公 司测 序 ， 结果 表 明 3 个基因完全一样 ， 片段长 1 3 6 6 个核苷酸 ， 该序列在 G e n B a n k数据库上的登录号为 A Y 4 6 4 9 4 9 。由于 3种高 山被孢霉中 5 脱饱和酶基 因没有 差异 ， 因此它们的活 性仅决定于基 因的表达水平。 采用定量 P C R评价基 因的表达情况 ， 外标 的选择 非常重要 ， 本研究采 用细胞 中含量 丰富 的 1 8 S r D N A作 为外标 。首先根据 真菌通用 的 1 8 S r D N A引物 ， 从 3株 高山被孢霉 的总 D N A中通 过 P C R克隆 出 1 8 S r D N A片 段 ， 结果如 图 3所示 。高 山被 孢霉 M1 0 、 M 2 3和 M 6的 1 8 S r D N A 基 因 序 列 提 交 G e n B a n k ， 登 录 号 分 别 为 AY 5 4 6 0 9 7、 A Y 5 5 0 1 2 5和 A Y 5 4 6 0 9 8 。 b p 2 0 () 0 1 0 0 0 7 5 0 5 0 0 2 5 0 1 0 0 图 3 高 山被孢霉 M1 0 、 l v l 2 3及 M6的 1 8 S r D NA的 P C R克隆 1 ： DL 2 0 0 0Ma r k e r ； 2： M1 0； 3： M2 3； 4： M6 F 嚷3 Mo l e c u l a r cl o n i n g o f 1 8 S r DN A f r o m Mo r t i e r e U a a lpi n a s t r a i n s M 1 0。 l v l 2 3 an d M 6 b y PCR 2 2 定量 PC R标准曲线 图4是 1 8 S r D N A和 5 脱饱和酶基 因特异性引物 的 P C R扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 图谱 ， 1 8 S r D N A特 异性 引物扩增 片断为 1 5 2 b p ， A 脱 饱和酶 基 因特异 性 引物扩增 片段 为 2 2 4 b p ， 与理论 结 果完 全一 致。定量 P C R电泳结果( 图4 ) 表 明产物 条带非 常特异 ， 通过 T A 克隆定量 P C R的条带 ， 测序结果符合理论推断 ， 表明引 物设计符合定量 P C R的要求。 b p 2 0 0 0 1 O 0 0 7 5 0 5 00 2 5 0 1 0 0 图 4 1 8 S r DN A 和 5 脱饱和酶基因 特异性引物的 P C R扩增 F 嚷 4 P CR p r o d u c t s o f s p e c i fi c p r i me r s o f 1 8 S r D N A an d5 - l la t 坶 a c i d d e s a t u r a s e g e n e 1： DL 2 0 0 0 DNA Ma r k e r ； 2 4： 1 8 S r DNA P CR p r o d u c t s f r o m M 1 0 M2 3， M6； 5 7： A d e s a t u r a s e P CR p r o d u c t s f rom M1 0， M2 3， M6 图 5是 1 8 S r D N A和 脱饱 和酶 基 因荧光 定量 P C R的标准曲线 ， 两条标 准曲线都 获得 了好 的线性关 系， 相关系数分别 为 0 9 9 9 8和 0 9 8 9 8 ， 符合定 量 P C R 的要求 。 维普资讯 中国生物工程杂志 C h i n a B i o t e c h n o l o g y V o 1 2 6 N o 8 2 0 0 6 5 0 c r 0 4 0 l、 L 二 2 _ I 、 太 I O 。 、 l 。 1 0 “ -1 0 o - - 9 I - 8 i o - - 7 I - 5 1 0 “ - 4 0 “ - 3 l - 2 I - 1 0 h 阳 0 4 0 。、 、 | 、 、 l 、 l D H 0 - 9 - 8 - 7 1 0 6 o 5 - 4 o 3 2 - 】 Q i x x n t , I O _ n l 口 _ 1 O 图 5 I 8 S r D N A和 脱饱 和 酶基因荧光定量 P C R标准曲线 A： I g S r D N A荧光 定量 P C R标准 曲线 C o n c=1 0 ( “ c T 9 5 4 ) ， R =O + 9 9 9 8 ； B： A 脱饱和酶基因荧 光定量 P C R标准曲线 C o n c= 1 0( 埘 c T 2 8 3 7 ) R =0 9 8 9 8 F i g 5 S t a n d a r d c u r v e s o f r e a l t i me P CR 0 f 1 8 S r DNA a n d - f a t t y a c i d d e s a t u r a s e mRNA 2 3 5 脱饱和酶基因转录表达与 A A生产之间的关系 由于 3种不同的被孢霉培养时 间相 同时菌体 油脂 中 A A含量不 同， A A高产菌 种 M 6不 同培养 时间下 菌 体油脂 中的 A A含量 也不 同， 选 取 M 1 0 ， M 2 3 ， M 6三种 不 同的高 山被孢霉的 6 d培养物 以及 M6的 3 d ， 6 d和9 d 的培养物作为样本 ， 检测 A A的生物 合成产量 以及 5 脱饱和酶基因转 录表达水平 ， 可以考 察培养 物 中 脱 饱和酶转录表 达与菌 体油脂 中 A A含量 的关 系 ， 结果 ( 表 1 ) 表明 5 脱饱 和酶基 因 m R N A 的相 对浓度与培 养物油脂 中 A A含量具有正相关关系 ， 随着高 山被孢霉 培养物中 脱饱 和酶 基 因表 达水平 的 提高 ， 油脂 中 A A含量也增加 ， 这种关 系同时存在于不 同 A A产量的 高 山被孢霉菌株 中， 以及 高产 A A菌株 M 6的不 同 A A 合成 阶段 ， 显示 5 脱饱 和酶基因表达直接影 响 A A的 生物合成。计 算 5 脱饱和 酶基因表 达和不 同菌株之 间t A A产生之间的关 系， 得出线性方程 为 ： Y = 6 9 5 8 8 x 表 1 真菌培养物的 脱饱和酶基因表达与培养物油脂中花生四烯酸含量的关系 Ta b l e l Re l a t i o n s h i p b e t we e n r e l a tiv e c o n t e n t o f f a t t y a c i d d e s a t u r a s e mRNA an d AA c o n ten t i n f e n g a l H p i d s o f d i ffe r e n t f I l n g a l c u l t u r e s +1 1 2 9 6 ， R = 0 9 8 9 6 ； 计 算 5 脱饱 和酶基 因表达 和 高产 A A菌株 M 6在第 3 d ， 6 d ， 9 d A A生产之 间的关系 ， 得出线性 方程 为 ： Y= 3 5 7 9 5 x +2 2 7 6 9 ， R = 0 9 4 6 5 。 其中 Y 表示培养物 油脂 中 从 含量 ( ) ， x表示 5 脱 饱和酶基因的相对表达水平。结果表 明， 5 脱饱和酶 基因的表达与高 山被孢霉 中 A A产量存在 明显的线性 关系 ， 暗示 5 脱饱和酶在高 山被孢霉 的 A A合成 中起 到了重要作用。 3 讨论 A A是 n - 6系列的一种 多不饱 和脂肪酸 ， 作 为合 成 人体前列腺素 、 凝血嗯烷 以及 白三烯 的前体物 质 ， 具 有 广泛 的生物活性 ， 而且它还具有 重要 的营养 作用 ， 是人 类 的必需脂肪酸之一。从 作 为人母乳 的天然成分 ， 对 于婴儿 的神经及生理 的发育必 不可少 ， 目前 已经被 多 个专 家组织包括世界卫生组 织推荐作为营养补充剂添 加到婴儿配方奶 粉 中 。A A在 生物 体 内的合成受 到 脱饱和酶和延长酶的共同作用 ， 本文采用定量 P C R技 术对催化 A A生物合成最后一个脱饱 和酶 5 脱饱 和酶在 A A生物合成中的作用进行 了评价。 实时荧光 定 量 P C R技 术 ( r e a l t i m e P C R) 是 1 9 9 6 年美 国 A p p l i e d B i o s y s t e m s 公 司发 展起来 对 模板 D N A 片段进行定 量研究 的办法 ， 是 目前为止最 精确 和可靠 的技术 ， 被广泛应用在研 究基因表达 ， 基 因转移评价 以 及病原体检测等方面 。外参的选择对于研究特异基 因在不 同环境条件下的表达非常重要 。T h o m a s 等研究 了4种常 用看家 基 因， 包 括 B 一 肌 动蛋 白 ，13 - 2 微 球蛋 白， 3 磷酸甘油醛脱氢酶 ( G A P D H) 和 1 8 S r D N A对外 界刺激 的应答反应 ， 发 现在 外界环境 刺激下 B 肌 动蛋 白和 G A P D H m R N A量分别增加 9倍和 3倍 ， 而 13 - 2 微 球蛋 白和 1 8 S r D N A增加 不大 ， 因此后两 者可作 为合适 的定量 P C R外标使 用 。而且 由于 r R N A 占总 R N A 维普资讯 2 0 0 6， 2 6 ( 8 ) 肖靓 等： 实时P C R分析 脱饱和酶在花生四烯酸合成中的作用 6 1 的 8 0 ， 其含量 变化受 外界环境 影 响很小 ， 本 实验 选择高 山被孢霉 的 1 8 S r D N A作为外标 。 高 山被 孢霉 M1 0 、 M 6 、 M 2 3是本 实验 室分 离 的产 A A的菌株 ， 它们在相 同培养条件下 ， 生 物量和总油脂 含量差别不大 ， 但油脂中 A A的含量有显著的差异 。通 过定量 P C R， 分析 了 脱饱 和酶基 因在 M1 0 ， M 6 ， M 2 3 同一培养时间 ， 以及高产 A A菌株 M 6在不 同培养 时间 的表达水平 ， 结合 A A的得率 ， 显示 5 脱饱和酶基 因表 达与培养物油脂 中 A A含量呈正 相关关系 ， 表 明 5 脱 饱和酶基 因的表达 直接影响花 生 四烯 酸 的生 物合成 ， 在花生 四烯酸生物合成中起到重要作用 ， 为 A A生产工 艺 的调控 、 高产 A A生产菌株 的筛选 和诱 变 ， 以及利用 代谢工程技术构建高产 A A菌株指明了研究方向。 参考文献 1 D a m r o n D S ，V a n Wa g o n e r D R， M o r a w e c c S ， e t a 1 A r ac h i d o n i c ac i d e n d o t h e l i n p o t e n t i a t e Ca 2 t r a n s i e n t s i n r a t c a r d i a c my o c y t e s v i a i n h i b i t i o n o f d i s ti n c t K c h a n n e I s J Bi o l Ch e m 1 9 93， 2 6 8： 2 7 3 3 5 2 7 3 4 4 2S o li v e n B，Wa n g W A r a c h i d o n i c aci d i nhib i t s p o t a s s i u m c o n d u c t a n c es i n c u l t u r e d r a t o lig ode n d r o c y t e s AI ll J P h y s i o 1 1 9 9 5 2 6 9 ( 2 P t 1 ) ： C 3 4 l 3 4 8 3S h i m a d a T，S o ml y o A P Mo d u l a t i o n o f v o l t a g e d e p e n d e n t C a c h a n n e l c ur r e n t b y a r a c h i d o n i c a c i d an d o t h e r l o n g c h a i n f a t t y a c i d s i n r a bb it i n t e s t i n a l s mo o t h mu Fc t3 l e J Ge n P h y s io 1 1 9 9 2 1 0 o： 2 7 4 4 4B o tha A，P a u l I ，R o u x c，e t a 1 An i s o la ti o n p r o c e d u r e f o r a r ac h i d o n i c a c i d p r o d u c i n g M o nie r e U a s pe c i e s Amo n i e v an L e e u w e n ho e k1 9 9 l97 52 5 3 2 5 6 5C h e nH c， C h angc c，C h e n cXO p ti m i z a ti o n o f a r a c h i d o n i c aci d p r o d u c ti o n b y Mo r t ie r e l l a M Wu j i H 4 i sol a t e J o u ma l 0 f the Ame r i c an Oi l Ch e mi s t s S o c i e t y1 9 9 7，7 4： 5 6 95 78 6Z h u M，Y u L J ，“u Z，e t a 1 I sola ti n g Mo r t i e r e U a 舱 s t r a i n s o f h ilg h yidd o f a r a c h i d o n i c a c i d L e tt e r s i n Ap p l i e d Mi c r o b i o l o g y ，2 0 0 4， 3 9： 3 3 2 3 3 5 7Z h u M，uu z ，Y u L J ，e t a 1 I sol a t i o n and f u n c ti o n a l i d e n ti fi c a t i o n o f A d e s a t u r a s e g e n e f r o m Mo r t i e r e l l a 8 P n a A c t a G e n e t i c a S i n i ca2 O 0 5 ， 3 2 ( 9 ) ： 9 8 6 9 9 2 8Z h uM Y u L J ， “uZ， e t a 1 I d e n t ifi c a ti o n o f a r ach i d o n i caci d h i g h y i e l d i n g s t r a i n M6 My c o s y s t e m， 2 0 0 4 ， 2 3( 4 ) ： 5 0 8 5 1 3 9Z h o u PP ， Y u L J ， wuYX， e t a 1 F e r m e n ta ti o n c o n d i ti o n s for a r a c h ido n i c aci d p r o d u c tio n b y Mo r t ie r e U a J ， m I n d u s t r i a l Mi c o r b i o l o gy ， 2 0 0 3， 3 3 ( 2 ) ： 4 1- 4 5 1 0 K n u t z o nD S ， T h u r mo n d J M， H u ang Y S I d e n t i f i cati o n o f D 5 一 d e s a t u r es ef r o m Mo r t ie r e l l a 8 b y h e t e r o lo ge u s e x p r e s s i o n i n b a ke rs y e a s t an d c a n o la J o u r n a l o f Bi o l o g i c a l Ch e mi s t r y， l 9 9 8 ， 2 7 3 ( 4 5 ) ： 2 9 3 6 02 9 3 6 6 1 1 “ M c，Wang J Q，X i n g L J Me thod for i sola ti o n o f R NA f r o m fi l a m e n t o u s f u n gi o f Mo r t i e r e U a i s a b e U i n a M y c esy s t e m， 1 9 9 9， 1 8 ( 1 ) ： 1 o 8l 1 1 1 2 wh i t e T J ，B r u n s T，L e e S ，e t a 1 A m p l i fi c a ti o n and d ir e c t s e q u e n c i n g o f f un g a l r i b o s o ma l RNA g e n e s for p h y l o g e n e ti c s I n：P CR Pr o t o c o l s ：A Gu i d et oMe thod s a n dAp p l i ca ti o n s S a n Di e g o：Ac a d e mi c P r e s s ，1 9 9 031 5-3 2 2 1 3 Z h u M， Y u L J ， Wu Y X Ap p li cati o n o f d e c osa h e x a e n o i c aci d an d a r ac h i d o n i c aci d i n i n f an t f o r mu l a Ch i n a Da i r y I n d u s t r y， 2 0 o 2， 3 0( 4 ) ： 2 2 2 5 1 4S u a i X R，X i a Q Y，Z h u Y P r o g r and a p p li cati o n o f q u a nti t a tiv e PC R Ne ws l e tte r o f Scr i c ult u r a l S c i e n c e 2 0 o 2， 2 2： 2 02 7 1 5 T h o ma s D S ，B r a i n A Z E ff e c t o f e x p e r i me n t a l t r e a t me n t帆 h o u s e k e e p i n g ge n e e x p r e s s i o n： v a l i d a t i o n b y r e a l t i me， q u a n ti t a t i v eRT - P C RJB i ach e m B i o p h y sMe t h o d s ， 2 O 0 O ， 4 6： 6 9 8 l 1 6 G o i d i n D，Mam e s s i e r A，S ta g u e t T M，e t a 1 R i b o s o m a l 1 8 S RNA p rev a i l s o v e Y g l y c e r a l d e h y d e - 3- p h o s p ha t e d e h y d r o g e n a ee an d B a c tin ge n es a s i n t e r n a l s t a n d a r d for q u a n tit a tiv e c o mp a r i son o f mRNA l e v e l s i n i n v a s i v e an d n o n i n v a s i v e h u ma n me l a n o ma c e l l s u bpo p ula ti o n s An a l y t i c a l Bi ac h e mi s 时 ，2 0 01， 2 9 5： l 72l An a l y z i n g Ro l e o f A De s a t u r a s e i n Bi o s y n t h e s i s o f Ar a c h i d o n i c Ac i d Us i ng Re al Ti m e PCR X I A O