五种重金属离子对克氏原螯虾的急性毒性作用研究.doc

五种重金属离子对克氏原螯虾的急性毒性作用研究宋维彦1，靳桂双1，毕伟伟2，田艳苓2，王 慧2，*（1.日照职业技术学院水产学院，山东 日照 276826；2.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018）摘要：采用静水生物法、充气和恒温法研究了重金属离子对克氏原螯虾的急性毒性作用。结果：五种重金属离子的毒性顺序为：Hg2+Cd2+Cu2+Pb2+Zn2+。采用直线内插法求得它们对克氏原螯虾24h、48h、72h和96h的半致死量（LC50），结果，五种重金属离子96h的LC50依次为：1.43mg/L，3.22mg/L，4.01mg/L，19.95mg/L和27.95mg/L。根据毒性分级标准，五种重金属离子对克氏原螯虾均为高毒物；且其安全质量浓度依次为：0.0143mg/L、0.0322mg/L、0.0401mg/L、0.1995mg/L和0.2795mg/L。以浓度对数和死亡率进行回归分析，得出了其24h、48h及96h的回归方程，五种重金属离子对克氏原螯虾96h的回归方程分别依次为：y=0.3147x-1.4195，Y=0.3132x-1.0586，Y=0.2419x+0.0904，Y=0.5064x-1.9294 and Y=0.3615x-0.3611。关键词：重金属离子；克氏原螯虾；急性毒性实验；安全质量浓度中图分类号： 文献标识码：A 近年来，随着全球环境的不断恶化，环境污染成了世人最关注的问题之一1-3。水体污染现象日趋严重，尤其是有害金属的排放量日趋增加，对水产品的养殖带来的危害越来越严重2。研究常见重金属对分布较为广泛的水产养殖动物的急性毒性作用，可以为准确和及时地把握各种水体的污染程度，了解不同水体的污染现状奠定基础，还可以为制定水质污染物最低安全指标提供科学依据，并为制定水产养殖动物的水体安全指标提供科学可靠的实验数据3。克氏原螯虾(Cambarus clakii)隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、螯虾科(Cambaridae)，俗称淡水小龙虾。原产于中、南美洲和墨西哥东北部地区，我国20世纪30-40年代从日本引进，日本于更早时期从美国引种。经过几十年的自然繁衍，克氏原螯虾已扩展至安徽、上海、江苏、香港、台湾等地，形成数量庞大的自然种群，成为我国种群数量最大的淡水经济虾类之一4。由于克氏原螯虾适应性广、繁殖力强，对水环境中发生的物理、化学和生物性的各种变化反应十分灵敏，故在毒理学和生态风险评价中具有重要的实用价值，也常作为一种环境预警生物4。铜、锌、铬等是生物体必需的微量营养元素，在机体的代谢中有着重要作用，机体内缺乏这些元素时，可引起器官机能下降，导致病变。汞、镉、铅、铜和锌是生物毒性较强的重金属物，也是常见环境优先污染物，他们对动物造成的危害较普遍5。重金属溶于水中，有多种络合态，金属离子通常只占总可溶金属的一部分，是唯一能与细胞膜载体蛋白结合的部分，具生物活性。此五种重金属在水中均以阳离子为主要存在形式。因此，本实验溶液中的五种金属离子的总浓度具有一定的代表性和相互之间的可比性。本试验对水体中Hg2+、Cd2+、Pb2+、Cu2+和Zn2+对克氏原螯虾的急性毒性效应进行了对比研究，旨在揭示水体中的重金属对克氏原螯虾的急性毒性效应和螯虾的抵抗作用，为克氏原螯虾对重金属的耐受能力评价、环境重金属污染防治和提高水产品安全性等提供科学依据，为螯虾养殖生产和捕捞环境中的水质管理提供科学依据。收稿日期：2008-10-11基金项目：山东省高等学校优秀青年教师国内访问学者项目经费和山东省博士后创新基金项目（200703044）资助。作者简介：宋维彦（1965-05），男，副教授，主要从事水产养殖研究。E-mail: .*通讯作者：王慧，博导。E-mail：1 材料与方法 1.1 试验动物克氏原螯虾捕获于自然河流，平均体重：31.250.5g。先在实验室水族箱内暂养2周。暂养期间正常投饵，死亡率低于5%。预备试验和正式试验的前一天均停止投饵。选择健康、活泼敏捷和体形大小均匀的个体进行随机分组，每组30尾。1.2 试验条件试验在水产养殖实验室内进行。玻璃水族箱规格：长宽高为906080 cm3，试验用水为充分暴气的自来水。水质标准为：PH为7.4-7.7；溶解氧DO5.5mg/L；总硬度（均值）为2.8mg/L；总碱度（均值）为2.5mmol/L；水温为25.50.5，自动控温。1.3 毒物试剂HgCl2、CdCl25H2O、Pb( NO3)2、CuSO45H2O和ZnSO47H2O等均为国产分析纯。配成3000mg/L浓度的母液，用时稀释成不同的浓度。1.4 试验方法采用静水生物测试法6-7，全过程不更换试验液，全天连续充气，自动控温，试验期间不投饵，以消除饵料的影响。自动控温。先进行预备试验以确定实验浓度范围。共设7个浓度组，每组30尾螯虾，均设3个平行实验组和对照组。及时观察记录动物的行为、中毒症状和死亡情况等。以玻璃棒刺激5分钟仍无反应者作为死亡个体的判断标准。1.5 数据的分析处理方法根据金属离子对克氏原螯虾的急性毒性试验结果，采用概率单位-对数图解法，分别求出在各重金属离子影响下，动物24h、48h、72h和96h的半致死质量浓度LC50；并根据毒性分级标准6-7对五种重金属离子对克氏原螯虾的毒性污染程度进行分级：LC5010000mg/L为微毒或无毒。采用以下公式计算各重金属离子的安全质量浓度：安全质量浓度I（SCI）= 96hLC500.01 （mg/L）统计分析各组在24h、48h、72h和96h时的死亡数和酶活力，采用SAS统计分析软件对实验数据进行方差分析和邓肯氏多重比较（Duncans Multiple Range Test）。2 结果与分析2.1 五种重金属离子对克氏原螯虾的毒性作用五种重金属离子在不同浓度下对克氏原螯虾的毒性作用的实验结果如表1所示。由表1可知，克氏原螯虾在五种重金属离子最低的实验浓度下均无死亡现象发生，试验中也未发现异常个体。从第二个实验浓度组开始，螯虾陆续出现中毒症状，且随着重金属离子浓度的增加，螯虾逐渐表现出明显的不安，先作快速游动状，而后活力逐渐减弱，并不时地进行侧游或侧翻，游速渐缓，对外界刺激的反应逐渐迟钝，游泳足逐渐停止运动，最后沉入水底死亡。早期中毒死亡个体的体态大多呈侧卧弯曲状；中后期死亡个体的体态以平躺者为多。死亡虾体的颜色也由健康时的淡紫红色逐渐变为灰白色，头胸部与腹部出现明显分节，虾体变软。在铅离子和锌离子溶液中中毒死亡的螯虾，体表粘附有许多棉絮状的白色小颗粒。各个对照组均为零死亡。表1. 不同重金属离子对克氏原螯虾的急性毒性试验结果Table 1. Results of acute toxicity of differential heavy metal ion on Porcambarus clarkia金属离子metal ion试验浓度（mg/L）Concentration（mg/L）不同试验时间下的死亡率 （%）The death rate in differential time (%)24h48h72h96h对照组Control group00000Hg2+0.200.601.051.552.102.903.80003.36.713.316.723.303.31016.723.34046.70101036.74056.766.701023.34053.380100Cd2+0.501.002.004.257.5011.0015.50003.36.71023.34000102026.766.676.7001043.353.383.310003.313.363.390100100Pb2+6.0010.0015.5021.0027.0037.0053.00003.31013.3204003.36.723.326.743.373.301026.730407093.301033.346.76086.7100Cu2+0.251.002.204.608.0014.522.5003.3101026.743.3001023.326.74073.303.313.3405063.310001026.746.763.380100Zn2+5.0010.0018.0031.0050.0080.00120.000006.716.73036.7006.7203046.776.706.716.733.35076.7100013.33046.766.7901002.2 五种重金属离子对克氏原螯虾的半致死量、安全质量浓度与回归方程对表1的数据进行统计分析，得出Hg2+、Cd2+、Pb2+、Cu2+和Zn2+对螯虾24h、48h、72h和96h的半致死浓度及其安全质量浓度，如表2所示。从表2可以看出，汞、镉和铜的毒性较大，其96h对螯虾的半致死浓度分别为：1.43mg/L、3.22mg/L和4.01mg/L。锌和铅对螯虾的毒性相对较小，其对螯虾96h的半致死浓度分别为：27.95mg/L和19.955mg/L。汞、镉、铜、铅和锌离子对螯虾的安全质量浓度分别为0.0143mg/L，0.0322mg/L，0.0401mg/L，0.1995mg/L和0.2795mg/L。我国淡水养殖用水水质标准中Hg2+、Cd2+和Cu2+的最高容许浓度规定值仅为0.0005mg/L、0.005mg/L和0.01mgL，可见，克氏原螯虾对水中汞、镉和铜离子的耐受性比国家规定的水质标准分别高出28.6倍、6.4倍和4.01倍。根据毒性分级标准6-11，由于五种重金属离子96h的LC50均大于1mg/L；而小于100mg/L，所以，它们对克氏原螯虾均为高毒物。以处理浓度与个体死亡率的关系进行回归分析，得到五种重金属离子对螯虾24h、48h、72h和96h的回归方程和相关系数，如表2所示。其96h的回归方程和相关系数分别依次为：y=0.3147x-1.4195，r=0.88；Y=0.3132x-1.0586，r=0.96；Y=0.2419x+0.0904，r=0.98；Y=0.5064x-1.9294，r=0.95；Y=0.3615x-0.3611，r=0.98。可见，五种重金属离子的毒性顺序为：Hg2+Cd2+Cu2+Pb2+Zn2+。表2. 金属离子对克氏原螯虾急性毒性试验数据的线性回归分析Table 2. Linear regression analysis of metal ion on death rate of Porcambarus clarkia金属离子Metalion时间Time(h)概率单位-浓度对数回归方程Probability unit-concentration logarithm regression equations相关系数与显著性水平Coefficient correlation and the significance level半致死浓度 LC50（mg/L）安全质量浓度Safe mass concentrationHg2+24Y=0.7568x-2.51920.7714*18.390.014348Y=0.5664x-2.16160.8998*4.6872Y=0.4833x-2.01180.9271*2.5496Y=0.3147x-1.41950.8814*1.43Cd2+24Y=0.7537x-2.20050.8141*36.990.032248Y=0.4952x-1.55690.9114*8.3172Y=0.3579x-1.13520.9215*4.5196Y=0.3132x-1.05860.9575*3.22Pb2+24Y=0.4725x-0.44930.8803*81.890.199548Y=0.3329x-0.07880.9293*38.5372Y=0.2828x-0.02250.9494*24.6396Y=0.2419x+0.09040.9818*19.95Cu2+24Y=0.8756x-2.68780.797*49.010.040148Y=0.6944x-2.31230.8874*14.4472Y=0.4597x-1.56070.8554*5.4796Y=0.5064x-1.92940.9458*4.01Zn2+24Y=0.6454x-0.92960.8617*198.340.279548Y=0.469x-0.48590.9275*72.2972Y=0.3531x-0.20780.9367*36.1396Y=0.3615x-0.36110.9848*27.95注：样本数为30. * 表示显著性检验水平，* 为p0.05；* 为p0.01。Notes：The number of samples is 30. * Stands the significance level, * is p0.05, and * is pCd2+Cu2+Pb2+Zn2+。在同类研究中也发现：汞的毒性最强5，7-9，11-13，15-16。但是Cd2+、Pb2+、Cu2+和Zn2+对不同的鱼虾则表现出不同的强弱顺序。Cd2+、Cu2+和Zn2+对鲫鱼的毒性从大到小依次为：Cu2+Cd2+Zn2+9；对真鲷幼鱼和黑鲷幼鱼的毒性则为：CuZnCd15；对罗氏沼虾为：Cd2+Cu2+Zn2+16。过量的重金属离子进入螯虾体内主要是通过鳃、皮肤和吞食食物三种途径，本试验为单一因子实验，而在实际水域中往往会几种因子共存，常表现为协同或拮抗作用。此外，盐度、pH值、水温、溶氧、氨氮等理化因子也能对金属离子的毒性产生影响17-20，因此，在实际生产中，还应考虑水中混合毒物毒性的变化和互作以及其它环境因子的影响。参考文献：1 Vander Oost Ron，Jonny Beyer，Nieo P E，et al. 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College of Animal Science &Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China）Abstract: The acute toxicity of Hg2+, Cd2+, Cu2+, Pb2+and Zn2+ were examined for Porcambarus clarkia Girard in terms of different consistency, through liner interpolation obtained the LC50 of the five heavy metal ions to the crawfish by stagnophile test, gas filling and constant temperature methods. Results showed that the order of the toxicities of these heavy metals was Hg2+Cd2+Cu2+Pb2+Zn2+ in turn. The median lethal concentrations(LC50) of Hg2+, Cd2+, Pb2+, Cu2+and Zn2+ for 24h, 48h, 7