小麦面粉强筋改良酶制剂研究进展.pdf

324 2013, Vol.34, No.09 食品科学 专题论述 小麦面粉强筋改良酶制剂研究进展 张 充，陆兆新* (南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095) 摘 要：面粉改良剂可以提升面粉品质，溴酸钾作为面粉强筋改良剂在面制品加工过程中已被禁止使用，寻找安全 的替代品成为食品添加剂研究领域的热点之一。酶本质是蛋白质，经过食品加工后对人体安全无害，是标准的可替 代溴酸钾的绿色食品添加剂。本文对目前国内外有关面粉强筋改良酶制剂的研究进展，包括面粉改良酶制剂的种 类、强筋的作用机制以及在应用中存在的问题进行综述。 关键词：小麦面粉；强筋；酶制剂 Research Progress of Enzyme Preparation for Wheat Flour Gluten Improvement ZHANG Chong，LU Zhao-xin* (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China) Abstract：Flour quality can be improved by improvers. Potassium bromate as a fl our gluten strength improver has been banned, and development of safe alternatives has become one of the hottest research topics in the fi eld of food additives. Since enzyme as one kind of protein, is harmless to human bodies after food processing, and it is a standard green food additive that can substitute potassium bromate. This article has reviewed current research progress of enzyme preparation for gluten improvement, including species, gluten strength mechanisms and the major problems during application. Key words：wheat fl our；gluten improvement；enzyme 中图分类号：Q814.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)09-0324-06 doi:10.7506/spkx1002-6630-201309065 收稿日期：2013-03-13 基金项目：国家自然科学基金项目(31201423；31071605)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(新教师类20120097120004)； 江苏省科技支撑计划项目(BE2011390)；苏州市科技支撑计划项目(SN201105) 作者简介：张充(1979)，男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail： *通信作者：陆兆新(1957)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail： 我国小麦品种众多，但面粉品质不高，在面粉后处 理阶段，往往应用面粉改良剂提升面粉品质。过去面粉 改良剂多以化学合成品为主，如溴酸钾等强筋剂和过氧 化苯甲酰等增白剂。由于溴酸钾可能导致动物的肾脏、 甲状腺及其他组织发生癌变，1992年WHO禁止使用溴酸 钾这种面粉强筋剂。我国也从2005年7月1日起全面禁止 溴酸钾用于面粉改良。为了避免化学改良剂所产生的食 品安全问题，而开发以酶制剂为主体的新型、安全、高 效的生物面粉改良剂，已成为国内外面粉加工业发展的 当务之急。酶作为一种纯天然生物制品其本身就是蛋白 质，经食品加工后不会对人体带来潜在的危害，因此酶 制品应用于面粉后期改良具有潜在的应用前景，也可弥 补我国国产小麦品质上的不足。面粉中蛋白含量一般在 8%14%，主要由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白 构成，其中后两者是主要的面筋蛋白；游离糖(包括戊聚 糖、阿拉伯木聚糖)占1%2%，脂肪占1%1.5%、灰分 与0.4%，此外还有维生素、矿物质等其他物质。酶可以 催化面粉中这些成份的聚合，而起到强筋的效果。目前 研究的在面粉中直接起到强筋作用的酶有以下2类：转 移酶类，以谷胺酰胺转氨酶为代表；氧化酶类，这类酶 中包括葡萄糖氧化酶、漆酶、过氧化物酶以及脂肪氧合 酶。本文综述了这几种酶在面粉强筋方面的研究进展。 1 谷氨酰胺转氨酶在面粉改性中的应用研究 谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，TGase，EC 3)是一种催化酰基转移反应的转移酶，广泛存在于 动、植物和微生物体内1。TGase催化机制如下：l)它可 催化在蛋白质以及肽键中谷氨酰胺残基的-羧酰胺基和伯 胺之间的酞胺基转移反应(图1a)，利用该反应可以将赖氨 酸引人蛋白质来改善面粉的营养特性；2)当蛋白质中的 赖氨酸残基的-氨基作为酰基受体时，蛋白质在分子内或 分子间形成-(-glutamyl) lys共价键(图1b)，通过该反应蛋 白质分子发生交联，使得食品以及其他制品产生质构变 专题论述 食品科学 2013, Vol.34, No.09 325 化，从而赋予产品特有的质构特性和黏合性能；3)当不 存在伯胺时，水会成为酞基的受体，谷氨酞胺残基脱去 氨基，该反应可以用于改变蛋白质的等电点及溶解度2-3 (图1c)。 Gln-C-NH2 + RNH2Gln-C-NHR + NH3 OO TG a Gln-C-NH2 + HOHGln-C-OH + NH3 OO TG c Gln-C-NH2 + H2N-LysGln-C-NH-Lys + NH3 OO TG b 图 1 TGase催化反应机制 Fig.1 Catalysis mechanism of TGase TGase促使蛋白质发生交联的条件是底物蛋白质需要 含有一定量的赖氨酸和谷氨酰胺，同时底物蛋白的结构 也对会其催化效果产生影响4-5。一些蛋白质，如酪蛋白 等较易在其催化下发生交联，因其含有较多的赖氨酸和 谷氨酰胺组分。肉制品、奶制品是TGase商业应用非常典 型的成功例子，主要原因还是由于这2种食物蛋白中存在 的氨基酸种类，能够很好的作为TGase的催化底物。 TGase应用于小麦面粉中，促使面筋中-Lys与-谷 酰基间的交联，从而加强面筋网络结构，起到氧化剂的 作用，改善面团的流变学性质，延长粉质稳定时间，改 善面团的延伸性及持水率，增大面筋网络的持气性6。 但是，由于面粉品质的差异，面粉中氨基酸种类和含量 的差异，对TGase的催化作用产生很大的影响。因此， TGase再面粉的实际生产加工与应用方面还有一定的距 离，但TGase的复配研究有可能解决底物不足的问题，如 复配中加二硫苏糖醇，打断蛋白质二硫键，暴露出更多 的可供TGase催化的位点7。 2 葡萄糖氧化酶在面粉改性中的应用研究 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)被认为是“最 有前途的绿色小麦粉强筋剂” ，其改良效果已得到广泛认 同。葡萄糖氧化酶在1982年首次发现于黑曲霉和灰绿青 霉，在有氧条件下氧化葡萄糖生成-D-葡萄糖酸内酯，同 时生成过氧化氢(H2O2)8。GOD对面团的氧化原理尚未达 成共识，但大多数学者认为GOD是通过氧化SH生成二 硫键起作用的。由图2可知，GOD在有氧条件下氧化D- 葡萄糖产生H2O2，后者在过氧化氢酶催化下氧化面团中 蛋白质的SH生成二硫键SS，从而增强面筋的 强度9。Wong10、Hanft11等发现，添加GOD可使面团内 WSH及SDSSH含量降低。Wikstrom等12研究了GOD 与蛋白酶、VC及溴酸钾对面团剪切阻力的影响，发现GOD 的作用方式与溴酸钾接近。另外，大量流变学研究13表明 GOD可改善面团的粉质拉伸及动态流变学特性，均为该 理论提供了佐证。 OH CH2OHCH2OH OH OHOHH H H H O O2 H2O2 H OH OH OHOHH H H H O O H ? ? ? ? S S HS SH ? ? + 图 2 GOD对面粉强筋机制 Fig.2 Flour gluten improvement of GOD 此外，也有学者14认为 GOD 还可以促进小麦粉中 水溶性戊聚糖的氧化凝胶化，进而增强面团的网络骨 架。Wang Mingwei等15的研究表明，戊聚糖酶(PE)与 GOD具有协同效应，前者水解面团内的大分子不溶性 戊聚糖(UEAX)，生成链较短的可溶性戊聚糖(WEAX)， WEAX在GOD的作用下发生链间交联形成凝胶，改善了 面团延展性及面包芯的品质。 国内外有关葡萄糖氧化酶的专利不是很多，国外 关于葡萄糖氧化酶的专利多集中在面粉强筋及面包焙 烤中的应用。国内黄卫宁等16用葡萄糖氧化酶替代溴 酸钾作为生物氧化剂添加到小麦粉中，增强了小麦粉 制品中面筋的筋力。黄卫宁等17将葡萄糖氧化酶和过 氧化氢酶用于抗冻发酵冷冻面团，利用葡萄糖氧化酶 和过氧化氢酶催化蛋白质之间交联，形成更加稳定的 面筋网络结构。 目前，GOD氧化形成二硫键的强筋机制是普遍 接受的观点，但是，仍有学者提出质疑。1998年， Vemulapalli等18最先发现了GOD对面筋蛋白并不起作 用。国际谷物化学界的权威Miller等19及其研究小组最初 也认为GOD的作用在于对面筋蛋白质的氧化，但随后的 研究发现GOD可能导致了多糖结构中阿魏酸与蛋白质中 酪氨酸的交联。因此，随着研究的深入，有学者认为上 述氧化蛋白质的机理不能完全揭示GOD对面粉的强筋机 制。另外GOD在实际的生产应用方面也存在着缺陷。首 先，缺乏优良的GOD基因，在体系中稳定性较差，容易 发生物理化学变性。另一个原因是缺乏高产GOD的菌种 及酶的大规模生产制备技术。因此，关于 GOD今后的研 究应集中在：1)彻底阐明强筋机理：GOD在面粉强筋过 程中除了催化二硫键的形成外，是否对面粉蛋白的其他 氨基酸，以及面粉中的多糖产生作用；2)筛选或突变获 得优良菌株：从多种环境中筛选产酶高、催化反应优良 的菌种，或者利用物理、化学、分子生物学手段对已有 的产GOD的菌株进行诱变处理。3)优良菌种的发酵条件 的探讨构建；4)建立大规模生产技术。 326 2013, Vol.34, No.09 食品科学 专题论述 3 漆酶在面粉改性中的应用研究 漆酶(laccase，Lac，EC)是自然界普遍存在的 一种含铜金属酶类，可催化各种酚类物质如儿茶酸、单 宁、黄酮等氧化为醌，是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称20。 Lac可以催化蛋白质发生交联聚合，可能是由于Lac能催 化蛋白质分子中的酪氨酸残基以及与蛋白质通过非肽键 相连的酚类化合物的氧化来实现21(图3)。另外，多酚氧 化酶可使酚类化合物氧化成醌，而醌类化合物也可与蛋 白质的氨基、巯基、吲哚基等基团发生反应从而导致蛋 白聚合。 OHO OOOO e-H + OC NH NH CH C C O X2 CH2 CH2CH2CH2CH2 CH2 O R RRRRR R HN OH OOC CO HCCH2 CH2CH HN NH HN CO = 图 3 Lac催化酪氨酸残基氧化 Fig.3 Tyrosine oxidation catalysis by Lac 在面团形成和烘焙过程中，Lac所参与的催化强筋作 用与阿魏酸和阿拉伯木聚糖有着密不可分的关系。Labat 等22报道了漆酶和阿魏酸在面团上应用的效果，当漆酶 与阿魏酸同时添加到生面团中，通过漆酶对阿拉伯木聚 糖中的阿魏酸酯的二聚作用来催化凝胶化；同时增加了 混合期间巯基的氧化作用以及蛋白质的解聚作用，在氧 化的面筋/水溶性戊聚糖混合物中发现阿拉伯木聚糖和蛋 白质之间的共价配合物。氧化酶增加了面团的连接性， 降低了阿拉伯木聚糖的水溶性，从而来提高面筋强度。 在面包加工方面，漆酶的使用可以增加面包体积，改善 面包结构和柔软性。Carunchio等23以真菌漆酶纯酶为研 究材料，发现漆酶具有使面粉多糖中的阿魏酸发生相互 交联的作用；Mattinen等21发现真菌来源的纯化的漆酶对 面筋蛋白中的酪氨酸有催化聚合作用。 目前，国内外研究主要集中于真菌漆酶，在菌种选 育、发酵条件以及在环境治理方面有大量的报道24-26。有 关漆酶在食品加工，尤其是面粉改良方面的研究报道还 不多。在食品加工中，可能受到制约的一个主要因素是 酶的热稳定性问题，因为绝大多数的真菌漆酶的热稳定 性不高。但有最新报道表明27-28，细菌漆酶，如芽孢杆菌 类的一些菌株，能产生耐热性良好的漆酶。今后在产酶 菌株方面的研究应关注于细菌来源的漆酶。 4 过氧化物酶在面粉改性中的应用研究 过氧化物酶(peroxidase，POD，EC)是一类以 血红素为辅基的酶，广泛存在于各种动物、植物和微生 物体内，可催化过氧化氢对多种有机物和无机物的氧化 作用，当无过氧化氢存在时，氧分子可作为氢受体发生 氧化反应29。 国内外有关POD对面粉具有强筋作用的研究，主要 集中在对面粉中多糖、蛋白质的交联作用上。有学者30从 小麦面粉和小麦麸中分离了阿魏酰阿拉伯木聚糖，对POD 作用的氧化交联进行了研究，结果发现在POD/H2O2反应 体系下，可催化阿魏酰阿拉伯木聚糖二聚体的形成。 Figueroa-Espinoza等31研究了锰过氧化物酶(MnP)对 阿拉伯木聚糖的交联作用，结果表明MnP通过两条途径 催化面粉中相关物质的交联：1) MnP催化阿魏酰阿拉伯 木聚糖，产物半醌类阿魏酰阿拉伯木聚糖自由基，后者 催化面粉中自由巯基生成二硫键，从而发挥强筋作用； 2) MnP催化阿魏酰阿拉伯木聚糖脱甲基，生成咖啡酰阿 拉伯木聚糖，在Mn3+作用下生成半醌类咖啡酰阿拉伯木 聚糖，进而催化与含巯基氨基酸的聚合，形成糖类-蛋白 的复合体(图4)。 O O O OOOOOO OH OH S-R HS-R+ O O OH OH OH O O OCH3 OCH3 H2O2 CH3OH Mn 3+ Mn 2+ MnP R-S-S-R R-SH R-SH ? ? ? ? ? ? ? ? ?-? ? ?a ?b 催化 图 4 POD催化含巯基氨基酸的聚合(a)和 POD催化阿魏酰阿拉伯木聚 糖与巯基氨基酸二聚体形成(b) Fig.4 Polymerization of mercaptoamino-acid catalysis by POD (a) and dimerization of feruloylated arabinoxylans and mercaptoamino-acid catalysis by POD (b) Oudgenoeg等32研究发现辣根过氧化物纯酶能够催化阿 魏酸与酪氨酸的聚合作用。Boeriu等33也发现在POD/H2O2 的作用下可使酪氨酸与阿魏酰阿拉伯木聚糖发生交联聚 合，首先是酪氨酸残基与阿魏酰阿拉伯木聚糖中的酚基 作为供氢体在POD/H2O2的催化下氧化而分别形成酪蛋白 的聚合体与阿魏酰阿拉伯木聚糖的聚合体(图5)。 专题论述 食品科学 2013, Vol.34, No.09 327 HO O O O O + + O O OH N N OHOOH OH OH O N N O OCH3 OCH3 OCH3 H3COH3CO OCH3 NH2 NH2 NH2 NH2 OH OH O O N N N N O O O O O O O O O O OH OH OH OH OH OHOH HO HO ( FA) (GYG) ? ? ? 图 5 POD催化酪氨酸与阿魏酸聚合 Fig.5 Polymerization of tyrosine and ferulaic acid catalysis by POD 根据目前研究报道，对POD增强面筋交联作用的可 能机制归纳如下：1)面粉中多糖物质的交联作用：POD 催化水溶性阿魏酰阿拉伯木聚糖二聚体的形成；2)面粉 中蛋白质间的交联：POD催化含巯基的氨基酸之间的二 硫键的形成；3)面粉多糖与蛋白质间的交联作用：POD 催化酪氨酸与阿魏酸间醚键的形成；POD催化阿魏酰阿 拉伯木聚糖与巯基氨基酸聚合体的形成。 5 脂肪氧合酶在面粉改性中的应用研究 脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX，EC2)，是 一种含非血红素铁的蛋白，酶蛋白由单肽链组成，分子 质量范围一般在90000100000D之间，专门催化具有顺, 顺-1,4戊二烯结构的不饱和脂肪酸的加氧反应，形成具有 共轭双键的氢过氧化物，这些氢过氧化物性质活泼，是 重要的化学反应中间体34。研究表明，面粉中添加大豆 粉而产生的强筋和漂白作用是由大豆粉中的脂肪氧合酶 引起的35-36。Dunnewind等37以纯化的大豆LOX为材料， 研究发现LOX纯酶能够提高面团的拉伸性能和持水性。 Toyosaki等38通过SDS-PAGE的方法研究了LOX对面筋蛋 白的聚合作用，结果表明经LOX处理的样品，经SDS-PAGE 检测出的分子质量明显高于对照组。 早期研究认为39，由大豆粉中LOX催化不饱和脂 肪酸形成的氢过氧化物能氧化蛋白质分子中的SH形 成SS并能诱导蛋白质分子聚合，使蛋白质分子变 得更大，从而起到强化面筋的作用(图6)。 随着研究的深入，学者们也都推测LOX与面筋筋力 相关因素面粉中淀粉多糖以及面筋蛋白中的氨基酸 有着密不可分的关系，但是缺乏有力的实验证据。然而 在用商品化的LOX纯酶为材料进行的研究中，只是研究 了面团流变学和拉伸性能等宏观变化等37，但是没有对强 筋机制进行深入研究。因此，严格地说到目前为止，LOX 在面粉强筋机理还没有清楚地被阐明。需要针对LOX的 单一组分与面筋蛋白、面粉中多糖之间的酶促机制进行全 面、深入的研究。而目前商品化的LOX纯酶提取工艺复 杂，价格昂贵，即使明确了其机理，高成本也会制约LOX 应用前景。因此，探寻能获得低成本、高纯度的酶的研究 材料，是解决LOX在面粉强筋应用的关键因素。 ? Fe2+ H H O2 O2 O2 O2 O2 O2 11 109 913 11 OOH HOO ?S?S? ?SH ?SH 1213 ? 图 6 LOX催化面粉中二硫键的形成 Fig.6 Formation of disulfi de bond catalysis by LOX in fl our 南京农业大学食品学院，就有关LOX的基因的挖掘、 应用展开了大量研究。从鱼腥藻PCC7120(Anabaena sp. PCC 7120)的基因组中克隆获得脂肪氧合酶基因。在E.coli中 获得了高效活性表达，表达量比已报道的最高的重组 LOX酶活提高了50倍以上，通过简单纯化过程获得了 纯酶40，并对其在面粉中的应用进行了研究，发现重组 Ana-LOX对面筋蛋白具有很好的交联效果(图7)。经过重 组Ana-LOX改良的面团制作出的面包体积，明显优于未 处理的对照组。 AB C A.未处理；B.重组Ana-LOX处理；C.溴酸钾处理。 图 7 面团的SEM显微结构图 Fig.7 SEM of dough 328 2013, Vol.34, No.09 食品科学 专题论述 同时，为了实现重组Ana-LOX的低成本纯化目的， 进行了Ana-LOX的食品级枯草杆菌表达系统研究。构建 了一个Ana-LOX的高效分泌表达载体，建立了一套枯草 杆菌无抗生素筛选的方法，构建获得了具有自主知识产 权的食品级工程菌宿主菌41-42。 而在应用过程中，目前已被发现的脂肪氧合酶，包 括Ana-LOX的热稳定性并不理想。针对该问题，本实验 室也在尝试通过非理性设计和理性设计的方法提高Ana- LOX的热稳定性。非理性策略中，对于突变基因的高通 量筛选方法的建立是至关重要的。例如郭芳芳等43建立 了碘化钾-淀粉法快速测定脂肪氧合酶的方法，获得的突 变体LOX-120、LOX-422在50条件下的半衰期t1/2比野 生酶分别提高到1.9倍和1.8倍。 理性设计是建立在对目标蛋白结构了解较为深入 的基础上。大豆脂肪氧合酶的晶体结构已被解析，通过 同源建模可以预测不同来源的脂肪氧合酶的空间结构。 Cristea等44在研究Mn脂肪氧合酶过程中，在模拟Mn脂肪 氧合酶空间结构和活性中心的基础上，对其进行了定点 突变研究，发现突变基因表达出的重组酶丧失了活性， 进一步研究发现突变重组酶检测不到Mn离子，该结果提 示活性中心的氨基酸残基的改变对酶的性质具有重要影 响。课题组运用生物信息学相关软件，预测了Ana-LOX 的三维空间结构(图8a)及Ana-LOX活性中心位点(图8b)， 定位铁离子的5个氨基酸残基分别为His197、His202、 His369、Asn373和Ile455。为了验证上述预测，已对上述 5个位点进行了大量定点突变研究。虽然未获得性质改良 的酶基因，但证实了上述5个位点确实为Ana-LOX的活性 中心位点40。因此，在此基础上，对活性中心周围(空间 结构)进行定点突变，获得热稳定提高的酶基因，具备一 定的理论基础和技术的可行性。 455-Ile-COO N His 202 Fe(?) 197-His-N O-ASN-373 N-His-369 His369 His202 Ile455 His197 ab HH O Asn373 Fe3+ - 图 8 Ana-LOX模拟的三维空间结构(a)和 Fe3+在Ana-LOX活性 中心定位模型(b) Fig.8 Analogous three-dimension structure of Ana-LOX (a) and analogous allocation of Fe3+ in the active center of Ana-LOX (b) 6 其他酶类在面粉改性中的应用研究 除上述在面粉加工中可以起到直接催化交联的酶之 外，还有一些酶通过其在面粉中的催化反应，间接的起 到强筋的效果。脂肪酶可以将甘油三酯水解生成甘油二 酯或甘油一酯或甘油，面粉中的脂肪经脂肪酶分解后生 成具有乳化作用的物质，在面筋网络和淀粉之间起乳化 的作用，改善面团的结构，增大面制品的体积45。淀粉 酶是一种在面粉改良中应用非常普遍的酶制剂，其效果 非常显著。-淀粉酶可以作用于面粉中的破损淀粉，生 成糊精，使得面粉的结构细密，在加工过程中会很好的 增加持汽性。另外，经淀粉酶作用后产生葡萄糖，增加 GOD的底物，强筋效果优于单独添加GOD。添加淀粉酶 也要适量，过度添加会使面制品的体积变小，而且容易 老化46。戊聚糖酶可以将水不溶的戊聚糖分解为水溶性 的戊聚糖，并伴随游离阿拉伯基木聚糖和阿魏酸含量的 提高，从而增强漆酶和过氧化物酶的作用效果47。 7 结 语 随着人们生活水平的提高，对面制品的安全性、品 质性的要求也逐步提高。溴酸钾作为传统的面粉强筋剂 已被取缔，绿色天然的酶制剂是最佳的面粉强筋剂。目 前，多种酶已发现在面粉强筋过程中起到直接的催化作 用，而纯酶制备成本过高是制约应用的主要瓶颈。在阐 明酶催化强筋机制的基础之上，研究方向的重点趋向于 如何获得大量纯化酶制剂、如何解决酶制剂的储藏稳定 性和在面粉加工中稳定性问题。另外，通过应用宏基因 组学、生物信息学、结构生物学以及分子生物学的方法 和手段，探索和开发新的面粉改良酶制剂，实现酶制剂 在面粉加工中的应用。 参考文献： 1 MOTOKI M, SEGURO K. 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