微射流均质预处理提高大豆分离蛋白酶解效率及酶解产物乳化性能.pdf

第 31 卷 第 5 期 农 业 工 程 学 报 Vol.31 No.5 2015 年 3 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Mar. 2015 331 微射流均质预处理提高大豆分离蛋白酶解效率及 酶解产物乳化性能 陈 林，吴克刚，柴向华，余 林 （广东工业大学 轻工化工学院食品系，广州 510006） 摘 要：为了探讨微射流均质预处理对大豆分离蛋白酶解效率及酶解产物乳化性能的影响，该文研究比较了微射流均质 预处理前后大豆分离蛋白酶解产物的理化性质（水解度、亚基组成、蛋白溶解性、表面疏水性和分子量分布）和乳化性 能（通过测定分析样品乳状液的平均粒径和微观结构评估样品的乳化性能）的变化。研究表明：大豆分离蛋白经过微射 流均质预处理后采用木瓜蛋白酶水解，其酶解产物（水解度为 1.7%）与对照大豆分离蛋白和未经预处理的酶解产物相比， 在较低浓度下（30 g/L）制备出粒径细小的稳定乳状液（体积平均粒径1.6 m） 。微射流均质预处理提高了大豆分离蛋白 中 -7S 和 A-11S 亚基的酶解敏感性，使酶解产物在水解度 1.3%1.7%范围内蛋白溶解性显著增加（P0.05）。因此本试验 将微射流均质机的均质压力设定为 120 MPa，样品均质 2 次，然后用 NaOH 溶液调节样品 pH 值至 7.0。微射流均 质处理后的 SPI 样品 （microfludization treated SPI， MSPI） 立即进行蛋白酶水解改性。 1.2.2 蛋白酶水解及水解度（degree of hydrolysis，DH） 的测定 为了识别微射流均质预处理后大豆蛋白暴露出的酶 解位点，要采用专一性比较广泛的蛋白酶。因此本文选 择了酶解位点比较广泛的木瓜蛋白酶（Papain），据文献 报道此酶可提高大豆蛋白的乳化性能 10-11。采用 0.1 mol/L HCl 溶液和 0.1 mol/L NaOH 溶液调节样品分散 液至 Papain 的最适酶解 pH 值（7.0），并将水浴加热的 温度调节至 Papain 的最适酶解温度（50）。启动磁力 搅拌器，然后加入 Papain，开始酶解。酶解过程中采用自 动电位滴定仪自动滴加 0.1 mol/L NaOH 溶液入样品分散 液，从而控制样品分散液的pH 值恒定为7.0。酶解180 min 后，记录碱液消耗量，DH 的测定采用 pH-stat 法12。酶解 液在沸水浴中灭酶 15min，冷却后调节 pH 值至 7.0，经 真空冷冻干燥（真空度为 15Pa，冷阱温度为60）得到 粉末，研磨后过 40 目筛，于密封干燥容器中保藏备用。 在本论文中采用不同的蛋白酶/底物比例（E/S） （0.05%0.5%，质量分数）制备出 DH 从低到高，彼此 之间 DH 相差不大的一系列 SPIH（大豆分离蛋白酶解产 物）和 MSPIH（经微射流均质预处理后的大豆分离蛋白 酶解产物）。水解时间设定为 180 min，因为在预试验中 发现采用不同的 E/S 比例，DH 的增长都在 180 min 内趋 于平缓。此法优点是可以准确控制酶解产物 DH，且重复 性好。 样品编号由蛋白来源和DH组成。 例如MSPIH-1.7% 是指大豆分离蛋白经过微射流均质预处理，水解度为 1.7%。 1.2.3 蛋白质溶解性的测定 将样品分散到去离子水中配置成 10 g/L 的分散液， 调节 pH 值为 7.0 后，常温下（23左右）搅拌 2 h，然 后离心（12 000 g，30 min）取上清液。上清液中蛋白含 量采用 Lowry 法13测定，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）做标准曲线，测定 500 nm 处的吸光值。 蛋白质溶解性采用氮溶指数（nitrogen solubility index， NSI）表示：NSI=样品中可溶性蛋白质量(g)/样品中总蛋 白质量(g) 100%。 1.2.4 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 （sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE） 参照 Laemmli 的方法14。将样品溶解于样品缓冲液 （0.0625mol/L Tris-HCl buffer (pH=6.8)，20g/L SDS，5% （体积分数） 巯基乙醇， 25% （体积分数） 甘油和 0.1g/L 溴 酚蓝）中配置成浓度为 10 mg/mL 的分散液。95下煮 5 min，离心后（12 000 g，30 min）取上清液。每个样品 的上样量为 10 L。凝胶电泳在恒压下进行，在浓缩胶中 电压为 60 V， 进入分离胶后增至 150 V。 凝胶染色及脱色 后，在凝胶成像系统中进行成像处理。标准蛋白样品分 子量范围 6.5200 kDa。 1.2.5 乳状液的制备和测定分析 将样品分散到去离子水中制备成不同浓度的样品分 散液 （2060 g/L） ， 然后在常温下 （23左右） 搅拌 2 h。 将样品分散液和葵花籽油以 2080 体积比混合。混合液 先用高速剪切机混合 1 min，得到粗乳状液。然后采用高 压均质机，30 MPa 均质 1 次，制成乳状液。乳状液中加 入叠氮钠（0.2 g/L）抑制微生物生长。 乳状液样品的平均粒径和粒度分布采用 Mastersizer 2000 粒度分布仪测定，葵花籽油和水的折射率分别为 1.462 和 1.330， 平均粒径表示为表面积平均粒径 （d32， m） 和体积平均粒径（d43，m）。 乳状液样品的微观结构采用激光共聚焦显微镜 （confocal laser scanning microscopy， CLSM） 观察。 CLSM 在荧光模式下运行，采用 63 倍水浸物镜。乳状液油相采 用 Nile Red 染色，当油相被染色后，在显微照片中呈现 出亮色，而没有被染色的水相则呈现出暗色。 1.2.6 表面疏水性（H0）测定 参照 Alizadeh 等的方法15， 采用 ANS 荧光探针法测 定样品 H0。将样品分散于磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L， pH=7.0） 中配制成质量浓度为 （0.040.2 g/L） 的分散液， 第 5 期 陈 林等：微射流均质预处理提高大豆分离蛋白酶解效率及酶解产物乳化性能 333 离心后（12 000 g，20 min）取上清液。向 4 mL 的样品液 中加入 20L 的 ANS 溶液（8 mmol/L），混合均匀，迅 速测定混合液的荧光强度。激发波长和发射波长分别是 390 和 470 nm。以未加荧光探针的相应浓度的样品溶液 作为空白。样品浓度对荧光强度作图，采用最小二乘法 进行曲线拟合，直线的斜率即为蛋白样品的表面疏水性 （H0）。 1.2.7 体积排阻色谱（size exclusion-high performance liquid chromatography，SE-HPLC） 采用 KTA UPC10 蛋白分离纯化系统，分离柱为 Superdex-peptide_10/300_GL 预装柱（柱床体积(Vt)= 24.0 mL， 孔隙体积(V0)=8.0 mL） 。 样品质量浓度 3 mg/mL， 进样量 100 L，检测波长 214 nm，洗脱液为磷酸盐缓冲 液（0.01 mol/L，pH=7.2，0.1 mol/L NaCl），洗脱流速 0.5 mL/min。 所用标准蛋白样品的分子量和相应洗脱体积 为：胰酶抑制剂（6.5 kDa，16.94 mL），核糖核酸酶 A （13.7 kDa， 14.23 mL） ， 碳酸酐酶 （29.0 kDa， 12.42 mL） ， 卵清蛋白（43.0 kDa，10.86 mL），伴清蛋白（75.0 kDa， 9.69 mL）。分子量与有效分配系数 Kav的关系为： Kav=0.424 lgMW+2.163，R2=0.988。其中Kav=VeV0/VtV0， Ve为洗脱体积，mL；MW 是样品分子量，Da。 1.2.8 数据分析 试验中所有结果都是 3 次测定的平均值，计算标准 偏差。采用 Duncan 新复极差检验评价样品平均值间的显 著性差异（P0.05); SPIH: hydrolysates of soy protein isolate, MSPIH: hydrolysates of microfluidization pretreated soy protein isolate, the same below. 2.2 SPIH 和 MSPIH 的乳化性能 本论文采用具有不同 DH 的 SPIH 和 MSPIH 制备出 一系列乳状液，然后通过研究分析乳状液的性质，分析 样品的乳化性能。 2.2.1 水解度对 SPIH 和 MSPIH 制备的乳状液的平均粒 径d43的影响 具有界面活性的蛋白质可以降低油水界面的张力， 使之易于乳化，形成粒径细小的乳液滴；蛋白吸附到乳 液滴表面后可形成界面膜阻止液滴重新聚结，起到稳定 乳状液的作用。因此在相同乳化条件下，不同蛋白样品 制备的乳液滴平均粒径越小， 则其乳化能力越强16。 SPIH 和 MSPIH 制备的乳状液的平均粒径（d43）随 DH 的变化 如图 2 所示。 注：SPIH：大豆分离蛋白酶解产物，MSPIH：经微射流均质预处理后的大豆分 离蛋白酶解产物，下同。乳状液成分：20%（体积分数）葵花籽油，20gL-1蛋白 样品，pH=7.0。 Note: SPIH: Hydrolysates of soy protein isolate, MSPIH: hydrolysates of microfluidization pretreated soy protein isolate, the same below. Emulsion composition: 20% (volume percentage) sunflower oil, 20 gL-1 protein sample, pH=7.0. 图 2 酶解产物的水解度对其制备的 乳状液平均粒径（d43）的影响 Fig. 2 Influences of degree of hydrolysis of hydrolysates on mean droplet size (d43) of emulsions 本试验中， 蛋白样品质量浓度定为 20 g/L。 因为此浓 度下 SPI 制备的乳状液具有相对较大的平均粒径 （d4327.6 m），如果 SPIH 或 MSPIH 的乳化能力提高， 其制备的乳状液的平均粒径将会减小。 与 SPI 相比， MSPI 制备的乳状液的平均粒径较小（P0.05），表明微射流均 质处理对 SPI 的乳化能力有一定改善作用。SPIH 乳状液 和 MSPIH 乳状液的 d43DH 曲线变化规律相似： 随着 DH 增大，d43逐渐减小，在一定 DH 范围达到最小值，然后 随着 DH 增大，d43迅速增大。Papain 酶解改性对 SPI 的 乳化能力改善有限，因为最小的 SPIH（DH=0.6%）乳状 液的 d43也有 15.6 m。然而在 DH=1.3%1.7%，MSPIH 制备的乳状液平均粒径 d436.0 m，为所有样品中最小。 2.2.2 水解度对 SPIH 和 MSPIH 制备的乳状液的微观结 构的影响 本试验中，乳状液的微观结构采用 CLSM 观察，液 滴粒径分布采用粒度分布仪测定。 2 种手段测定结果相结 合可以比较准确反映乳状液的微观结构和组成16。图 3ac 为 SPIH 乳状液的微观结构和粒径分布随 DH 的变 化。如图 3a 所示，对照 SPI 制备的乳状液出现了严重的 絮凝（乳液滴聚集在一起），原因可能是均质过程中产 生的乳液滴表面没有被蛋白质完全覆盖，因而小液滴之 间发生了桥联絮凝17。液滴絮凝体的大小主要分布在 10100 m。对于 SPIH-0.6%制备的乳状液（图 3b）， 虽然细小液滴（0.11 m）数量增多，但是此乳状液仍 然出现了明显的絮凝。这可能是因为经过轻度酶解后， SPIH-0.6%中生成了一些具有良好界面活性的多肽，在均 质过程中可以形成并稳定一些小液滴，但是它们的量不 足以覆盖所有液滴的表面，因而液滴间的桥联絮凝仍然 发生了。这一发现与之前的文献报道一致10, 11，说明 Papain 轻度酶解可以提高 SPI 的乳化能力， 但是由于大豆 蛋白致密的球状结构对蛋白酶的水解作用有很强的抵抗 力，且不同亚基的酶解过程不同步，导致酶解生成的具 有界面活性的可溶性肽难以富集，大大制约了大豆蛋白 酶解改性的实际效果。对于 SPIH-1.1%制备的乳状液（图 3c），桥联絮凝变得更加严重，且液滴粒径分布向大粒径 方向迁移。另一个值得注意的现象是，SPIH-1.1%乳状液 中的絮凝体主要由大液滴组成，而对照 SPI 乳状液中的 絮凝体主要由细小液滴组成。这些观察结果都表明过度 酶解反而导致了 SPIH 乳化能力下降。 MSPIH 在不同 DH 下制备的乳状液的微观结构和粒 径分布如图 3df 所示。MSPI 制备的乳状液的液滴絮凝 现象有所改善，同时含有一些细小的液滴（0.11 m） （图 3d）。对于 MSPIH-1.7%制备的乳状液（图 3e），最 明显的变化是没有出现明显的液滴絮凝，表明液滴表面 形成了完整的界面膜。此外，与 SPIH-0.6%相比， MSPIH-1.7%制备的乳状液含有更多细小的液滴（0.1 1 m）。这些现象可能意味着 MSPIH-1.7%中含有更多的 具有良好界面活性的可溶性多肽。 对于 MSPIH-2.5%制备 的乳状液（图 3f），液滴大而絮凝，粒径分布向大粒径 方向迁移，这表明过度酶解同样会导致 MSPIH 的乳化能 力下降。 第 5 期 陈 林等：微射流均质预处理提高大豆分离蛋白酶解效率及酶解产物乳化性能 335 注：SPI：大豆分离蛋白，MSPI：经微射流均质处理的大豆分离蛋白，DH：水 解度，下同。样品乳状液的显微照片上添加了对应的粒度分布曲线，水平刻度 表示粒径大小（m）。乳状液成分：20%（体积分数）葵花籽油，20 gL-1蛋白 样品，pH=7.0，下同。 Note: SPI: soy protein isolate, MSPI: microfluidization treated soy protein isolate, DH: degree of hydrolysis, the same below. Droplet size distributions of emulsions are superimposed on the micrographs, with horizontal scale indicating particle size in micrometers. Emulsion composition: 20% (volume percentage) sunflower oil, 20 gL-1 protein sample, pH=7.0, the same below. 图 3 不同蛋白样品制备的乳状液的微观结构 Fig.3 Microstructures and droplet size distributions of emulsions formed by different protein samples 2.2.3 不同蛋白样品浓度对乳状液平均粒径d43的影响 乳状液平均粒径 d43随不同蛋白样品（对照 SPI、 SPI-0.6%和 MSPIH-1.7%）浓度的变化如图 4 所示。对于 所有样品，随着浓度的增加，它们制备的乳状液的平均 粒径逐渐减小。蛋白样品浓度越高，其含有的界面活性 可溶性蛋白含量越高，因此在相同的乳化条件下有更多 的蛋白快速吸附到乳液滴表面从而形成并稳定更多的细 小液滴，使乳状液平均粒径下降17。在分别达到一定细 度后，乳状液的粒径不再随浓度的增加而变化，说明乳 化形成的液滴已基本都被稳定了。对照 SPI、SPIH-0.6% 和 MSPIH-1.7%能够制备出稳定乳状液的最小浓度分别 为 50，45 和 30 g/L，对应的平均粒径 d43分别为 1.5，1.2 和 1.6 m。 这些结果表明， 与对照 SPI 和 SPIH-0.6%相比， MSPIH-1.7%能够在较低的浓度下制备出粒径细小而稳 定的乳状液，因此具有较强的乳化能力。换而言之，微 射流均质预处理可以提高 SPI 酶解产物的乳化能力。 图 4 乳状液平均粒径（d43）随不同蛋白样品浓度的变化 Fig.4 Influences of concentration of protein samples on mean droplet size (d43) of emulsions 2.3 SPIH 和 MSPIH 的物理化学性质 为了研究 MSPIH 乳化能力提高的潜在机理，本文进一 步测定分析了不同蛋白样品的表面疏水性和分子量分布。 2.3.1 水解度对 SPIH 和 MSPIH 的表面疏水性的影响 蛋白质的表面疏水性是与外界极性水环境相连的蛋 白质表面疏水性基团数量的一个重要标志，是决定蛋白 质界面活性及乳化性能的关键指标。要具有良好的界面 活性，蛋白质必须具有较高的表面疏水性2。SPIH 和 MSPIH 的表面疏水性值（H0）随 DH 的变化如图 5 所示。 SPI 的 H0为 1 109.8。据文献报道在植物蛋白中，大豆蛋 白具有较高的表面疏水性，可有效降低油水界面的张力， 而且许多疏水基团位于球状结构的内部，界面活性有很 大的改善潜力18。MSPI 的 H0（1 273.5）显著高于对照 SPI 的 H0（P0.05），说明适当的微射流均质预处理可以 提高 SPI 的表面疏水性，这与文献报道的一致6。随着 DH 的增大， SPIH 的 H0先升高， 在 DH=0.4%时达到最大 值 1 834.8，然后随着 DH 的继续增大而迅速下降。轻度 酶解可以破坏大豆蛋白的球状结构，使埋藏于分子内部 的疏水基团得以暴露，从而使 H0增大，酶解产物界面活 性增强。然而，过度酶解会导致大豆蛋白的 H0下降，这 可能是由于暴露的疏水基团成为酶解位点被破坏了；增 长的疏水相互作用导致多肽的聚集11。对于 MSPIH，随 着 DH 的增大，H0逐渐升高，在 DH=1.3%时达到最大值 1 614.2。然而值得注意的是，与 SPIH 相比，MSPIH 的 H0在达到最大值后随着 DH 的继续增大，下降的比较缓 慢。在 DH=1.7%时，MSPIH 的 H0为 1 021.7，仍保持了 较高的表面疏水性。 将 SPIH 和 MSPIH 的 NSI（表 1）、H0（图 5）与其 制备的乳状液的平均粒径 d43（图 2）、微观结构（图 3） 相对照，可以发现 SPI 的表面疏水性值较高，具有良好 的界面活性，可以有效地降低油水界面的张力，在乳化 过程中形成粒径细小的乳液滴。然而由于商品化 SPI 的 农业工程学报 2015 年 336 溶解性很低（NSI=21.6%）、分子柔顺性差（大分子球蛋 白），其在乳化过程中吸附到乳液滴表面的速率较慢， 液滴表面因此不能被蛋白完全覆盖，导致液滴间容易发 生桥联絮凝，因此乳化能力较差。单纯采用 Papain 控制 酶解改性，在较低 DH 下（0.6%），SPIH 的 H0显著增 大（P0.05），但是此时其 NSI 值仍然较低（36.5%）， 说明酶解生成的具有界面活性的可溶性多肽含量不高， 乳化能力改善有限。不溶性蛋白质对乳化作用的贡献很 少，这是由于蛋白质在它的表面性质能起作用之前必须 先溶解和移动到界面，而不能溶解的蛋白颗粒显然难以 做到快速移动和吸附到油水界面19。随着 DH 继续增大， 虽然 SPIH 的 NSI 值不断升高， 但是由于其 H0下降太快， 酶解生成的可溶性多肽的界面活性太差，乳化能力反而 降低了。然而 SPI 经过微射流均质预处理后，有些原来 难以被酶解的亚基（-7S 和 A-11S）的酶解敏感性明显 提高，MSPI 中不同亚基的酶解因此变得快速而协同。与 SPIH 相比，MSPIH 的 NSI 值随 DH 增长的更快，而 H0 随 DH 的变化相对平缓。因此 MSPIH 在一定 DH 范围内 （ DH=1.3% 1.7% ） 不 仅 蛋 白 溶 解 性 显 著 增 加 （NSI=51.3%58.2%）(P75.0 kDa；II， 1.575.0 kDa；III，75.0 kDa； II， 1.5 75.0 kDa；III，75.0 kDa; zone II, 1.5-75.0 kDa; zone III, 1.5 kDa. 图 6 不同蛋白样品的体积排阻凝胶色谱图 Fig.6 Size-exclusion chromatography profiles of different protein samples 3 结 论 本文研究表明 SPI 经过微射流均质预处理后采用 Papain 酶解，其酶解产物 MSPIH-1.7%与对照 SPI 和未经 预处理的酶解产物 SPIH-0.6%相比， 可在较低质量浓度下 （30 g/L） 制备出粒径细小且稳定的乳状液 （d431.6 m） ， 具有明显增强的乳化能力。通过研究比较预处理前后酶 解产物理化性质和结构的变化，发现微射流均质预处理 提高了 SPI 中难以被酶解的 -7S 和 A-11S 亚基的酶解敏 感性，MSPI 中不同亚基的酶解因此变得快速而协同。在 DH=1.3%1.7%范围内，MSPIH 的蛋白溶解性显著增大 （NSI=51.3%58.2%）（P0.05），同时保持了较高的表 面疏水性（H0=1 021.71 614.2），与 SPIH 相比形成了 更多具有界面活性的可溶性多肽（分子量主要分布在 11.3 kDa 左右） ， 在乳化过程中可形成粒径细小的乳液滴， 并有效防止液滴间发生桥联絮凝，使乳状液保持稳定。 综上所述，经过适当改性的大豆分离蛋白具有优异的乳 化能力，可应用于食品乳状液。微射流均质预处理是一 种辅助提高大豆蛋白酶解效率和酶解产物乳化性能行之 有效的方法。但微射流均质预处理后大豆蛋白究竟形成 了怎样一种易于酶解的结构尚不清楚，有待进一步研究。 第 5 期 陈 林等：微射流均质预处理提高大豆分离蛋白酶解效率及酶解产物乳化性能 337 参 考 文 献 1 田利春，傅亮，蒋笃孝. 乳化剂在食品工业中的应用进展 J. 农产品加工（学刊），2005(5)：5456. 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However, the poor emulsifying properties have limited the application of soy proteins in emulsion-based food products. Modification of soy proteins by enzymatic hydrolysis for improved functionalities is a well-accepted and safe method, but soy proteins are resistant to enzymatic hydrolysis due to their compact structures that protect many of the peptides bonds. Recently, it has been reported that microfluidization treatment can disrupt the quaternary and tertiary structure of globular proteins and break up protein aggregates, which may cause the exposure of more cleavage sites. However, limited information is available concerning the effects of microfluidization pretreatment on the enzymatic hydrolysis pattern of soy proteins or on the emulsifying properties of its hydrolysates. Hence, the objective of this work was to study the effects of combining microfluidization pretreatment and controlled enzymatic hydrolysis using Papain on the emulsifying properties of soy protein isolates (SPI). Microfluidizaiton pretreated SPI (MSPI) was prepared using a microfluidizer at a specific pressure level of 120 MPa. Papain was used as protease for the preparation of SPI hydrolysates (SPIH) and MSPI hydrolysates (MSPIH). Oil-in-water emulsions (20% v/v sunflower oil, 20 g/L protein sample, pH=7.0) were formed by SPIH and MSPIH with various DH (degree of hydrolysis). And the analysis of mean droplet sizes and microstructures of these emulsions showed that emulsions formed by control SPI and SPIH were unstable to bridging flocculation, suggesting their poor emulsifying capability. This findings may be explained by the fact that there were insufficient soluble protein with high surface activity existed in control SPI and SPIH. In contrast, some MSPIH (DH was 1.3%-1.7%) showed that the emulsifying capability and emulsions stabilization against bridging flocculation were markedly improved. Compared with control SPI and SPIH (0.6% DH), MSPIH (1.7% DH) was capable of producing a stable fine emulsion (d431.6 m) at a lower concentration (30 g/L), suggesting its better emulsifying capability. Composition of subunits, protein solubility (NSI), surface hydrophobicity (H0) and molec