微生物发酵生产DHA研究概况.pdf

2 0 0 2年第 9期 粮 食 与 油 脂 3 l 微生物发酵生产 DHA研究概况 焦迎春 ， 郑晓冬( 浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州 3 1 0 0 2 9 ) 摘要：本文综述 了微 生物发酵法生产二十二碳六烯酸 ( DHA) 的菌种、 培养条件、 提取及 纯化的 研究进展 ， 并浅析了存在的问题。 关键词：DHA； 微 生物油脂 ； 生物发酵 文章编号 ：1 0 0 8 -9 5 7 8 ( 2 0 0 2 ) 0 9 -0 0 3 1 0 2 中图分类号：TQ6 4 5 6 文献标识码 ：A 0 前 言 二 十二 碳六 烯 酸 ( DHA) 是 ( 0 3系 列 不饱 和脂 肪 酸 中一 种 ，人体 自身难 以合 成 ，必 须从体 外摄 入。 世界 卫生组 织 指出 ：人类所摄取总热量 中，至少要有 3 来 自于多烯脂肪酸 才能维持健 康C 2 j 。 当前 ， DHA 的主要来 源是海产鱼油 ， 如 沙丁 鱼、 乌 贼 肝 油和 金 枪 鱼、 松 鱼 的 眼 窝脂 肪。 但 从 鱼油 中提 取 DHA 存在 以下不足 ：( 1 ) 鱼油 中 DHA含 量不高 ， 且含有 大量 的 其它饱 和 及 不饱 和 脂肪 酸 ， 使 浓缩 较 为 困难 ； ( 2 ) 鱼油 中的 DHA 含 量不稳 定 ； ( 3 ) 鱼油易 于氧化 ， 有 鱼腥 味【 3 j 。 这使得 用 海产鱼 生产 DHA推 广受到 一定的限制 ， 因此 寻找更好 的生产 DHA 方法受到广泛 关注【 ， 。近年 来， 许 多研 究表明 ：一些微 生物具有 合成 DHA 的能力 ， 特别是在 某些低 等真菌和细 菌的 脂质中含有丰富 DHA， 可成为替代鱼油获取 DHA 的新资源。 l DHA微生物发酵生产 1 1 DHA微生物生产菌及合成途径 合成 DHA 的微生物 主要是较 低级真菌 中藻状菌 纲 ， 如 陆 生 和 海 洋 藻 状 真 菌 Mu c r a l e s 、 水 霉 目破 囊 壶 菌 T h a u s t o c h y t r i u m、 裂 殖 壶 菌 S c h i z o c h y t r i u m、 虫 霉 目 E n t o mo p h t h o r a o b u r a ， 均 能 产 生 较 高 含 量 DHA。B a j p a i等 发 现 破 囊 壶 菌 T h r a u s t o c h y t r e i u m a u r e u m AT C C3 4 3 0 4总 脂 肪 酸 中 5 0 为 D H A C 6 j 。另 外， 海 洋 隐 甲藻 C r y p t h e c o d i n i u m c o h n i i 的多个 菌 株 DHA 含量也较 高【 7 _ 。 微 生 物合 成 DHA 通 常 是从 单 不饱 和 脂肪 酸油 酸 开 始 ， 经过 ( 0 3 途 径或 ( 0 6途径 合成多 不饱和脂 肪酸 ， 其中主要 涉及 2 个 反应 ：碳链 的延 长和 去饱 和作用。这个过程 中参与 的 酶 系和作用机制与 高等 生物相似 【 8 _ 。 1 2微生物生产 DHA培养条件 1 2 1培 养基 一 般 而 言 ， 培养 基组 成对 菌体 生物 量、 脂含量 和 DHA 产 量均 有很大 的影响 ， 而对脂质 中的 DHA 含量影响 不大。生物 量 中脂含 量 与脂质 中 DHA 含量 呈 正相关 关系。微 生物 可利 用 葡萄糖 、 麦 芽糖 和淀 粉 生产和积 累脂 质 ， 虽然 其 DHA 含量 比以果糖、 蔗糖和乳糖 为碳源 时低 ， 但 从 DHA 产量来看 ， 以葡 萄糖 、 麦芽糖 和淀粉 为碳 源明显 优于果 糖、 蔗糖和 乳糖 。总 体 而言 ， 葡 萄糖 是 生产 DHA 常 用 的碳 源 ri o 。 不 同的葡 萄糖 添 加量会 对生物 量和菌 体 的 DHA 含量有 影响 ， 油脂 中 DHA 含量则 不受影响 ； 不 同氮源对菌 体脂含量和 DHA产 量有不同 影响 【 1 ， j 。 a u r e u m ATC C3 4 3 0 4在培 养基 含 0 2 谷 氨酸 钠 时菌体脂含量 和 DHA 产量 最高 ， Na k a h a r a等则采 用玉 米 浆 为 S c h i z o c h y t r i u m 的氮 源【 l 4 ， 而 培 养 S a p r o l e g n i a s p 2 8 YT F 一 1时就 以酵母抽 提物 最好 【 “ ， 在 培养 C c o h n i i 时添 加 精 氨酸盐 对藻 体量 、 总 脂 量和 DHA 量 均有 促进 作用 1 6 _ 。培 养基 中的 C N 比对 菌体 生长 、 脂质 积累和 DHA 产量 是有 影 响 的， 高 的 C N 比有利 于脂质 的积累 ， 但 C N 比过 高， 脂 质 中 DHA 含量将会 下降 ： 由于破囊壶菌等 均为海生真菌和 海生 藻 ， 因此培养 基中要添 加一定量 的无机盐 离子。We e t e 等发 现 收稿 日期 2 o 0 2 O 6 3 0 在培 养 T h r a u s t o c h y t r i u m s p AT C C2 6 1 8 5时 如不添 加矿 物 盐 溶液 ， 菌体 生物 量和脂 含量均 大幅 下 降【 1 2 _ 。应 该注意 的是培 养基 中添加痕量 元素有 一定浓度 阈值 ； 在用微 生物生产 DHA 时添加不饱和 脂肪酸、 有 机酸和碳水 化合 物等前体物质对产量 有刺激 作用 ， 常 用的 有丙酮酸 、 柠 檬酸 【 1 6 _ 、 硫胺 素和泛 酸钠 盐 等物质 9 J 。 1 2 2培 养条件 在 初始 p H4 9范 围内菌体 中 DHA 含量基 本保持不 变。 S u r e u m AT CC3 4 3 0 4在起始 p H6 0时生物量和 DHA 产量 最高【 引。 而 S c h i z o c h y t r i u m s p S R2 1 合 成 DHA 的最适 初始 p H 则是 4 C “ ， 不 同 的微生 物 需要 的最适 p H 值是 不 一样 的。 T h r a u s t o c h y t r i u m 和 S c h i z o c h y t r i u m 为 具 有光 刺 激 生 长特 性 的 海 生 真 菌 ， 因 此 ， 光 照 对 其 生 产 DHA 有 影 响 ， T ， a u r e u m AT CC3 4 3 0 4在 3 3 w 荧光 灯光照 下的生物 量和 DHA产 量都 比黑暗培 养时高 C 9 。微 生物合成 多不饱 和脂肪酸 过程 中的去 饱 和作 用 需要分 子 氧的参 与 ， 分子 氧 的有效 性 决定其 产 生脂 肪酸的不饱 和度 ； 因此 ， 提 高培养 基中氧浓 度有利 于不饱 和脂 肪酸 的合成【 1 1 。嗜冷微 生物比嗜温微 生物 能合成更 多的多不 饱 和脂 肪酸 ， 因为微 生物 常常 是通 过增 加生 物膜 脂肪 酸 的不 饱 和程 度提 高膜 的流 动性 来抵 抗低 温环 境。研 究 表明 ， 低温 能 促进 微 生物 合 成不饱 和 脂肪酸 ， 虽然 低温 十分 有利 于提 高 脂 质 DHA含量 ， 但不利 于菌体的生长和 脂质积累。大 多数微 生 物 的生物 量 、 油 脂量 和 DHA 产 量 随温 度升 高而 上 升并 在 2 8 达到 最 大值 ， 而油 脂 中 DHA 比例 随温 度 升高 却 有所 下 降。 为 解 决 这 一 矛 盾 ， 可 采 用 变 温 培 养。S i n g h等 在 培 养 T h r a u s t o c h y t r i u m s p AT C C2 0 8 9 2时采用 变温培养 ， 菌体 先在 2 5 培 养 1 天 ， 然后 降温至 1 5 “ C培养 3天 ， 结果 DHA 量大 幅 增J 1 3 。 1 2 3 发酵 周期 DHA 的发酵进程 符合 s型 曲线， 在对 数生长期 末期或稳 定期 初始 DHA 含量可 达 最大值。 a u r e u m AT CC 3 4 3 0 4和 T h r a u s t o c h y t r i u m s p AT C C2 6 1 8 5菌体 生长量在发 酵初期 呈线 性增长 ， 培养 的第六天生物量和菌体含量达到最大值C 6 ，9 ， l 2 。 a u r e u m AT C C2 8 2 1 0同样在培 养 5天后生物 量和脂 含量达到 最大值 ， 菌体 DHA含量和总量 随培养时 间进行而增加 ， 显 示其 与菌体产量 呈正相关关 系 。许 多微 生物在菌 体老化过程 中 不饱和脂肪酸含量下降 ， 但海藻随藻体老化 ， 其 DHA含量 大为 增加。 2发酵液中 DHA分离与纯化方法 2 1蒸馏法 由于脂肪酸 的沸点较高 ， 常压下蒸馏可能 出现分解现象 ， 可 采取如 下方 法 ：( 1 ) 减压 蒸馏 ( 压力 通常 要在 6 6 6 6 P a以下) ， 使 DHA在低 于它们 正常沸点 的情 况下蒸 出。( 2 ) 可 以将脂肪 酸酯化 ( 例 如 甲酯化和 乙酯化) 后再进 行蒸馏 ， 因为脂肪酸酯 的 沸点较相应 的游 离脂肪酸沸点低 ， 而且脂 肪酸 酯的沸点 间隔可 以拉开。( 3 ) 利用 高真空分子蒸馏法( 如 0 0 1 3 P a ) ， 在分离脂肪 维普资讯 3 2 粮 食 与 油 脂 2 0 0 2年第 9期 酸 时可 起 到浓 缩 、 分 离和 精 制 等 多方 面 效果 ， 已成 功 应 用 于 DHA 的分离精制 。 2 2 结晶法 结晶法提取 DHA有 两种方式 ：( 1 ) 低 温结晶 ， 利用 饱和脂 肪酸凝 固点高于不饱和脂肪酸的特性将混合脂肪酸 中不饱和脂 肪酸分离开 ； 另外 ， 可利用脂肪酸在有机溶剂 ( 常用丙酮 ) 中溶解 度与碳链的长度成反 比特性 ， 再结合低温处理 ， 使脂肪酸达到初 步分 离的 效果 ， 使产物 中 E P A和 DHA达 到总 脂肪酸 2 5 3 5 。( 2 ) 脂 肪酸盐结 晶， 是 利用饱和脂 肪酸、 不饱和脂 肪酸 以及 EP A 和 DHA 的金属 盐在某 种溶剂 中溶 解度的不 同进行 分离。如铅盐 ( 醇 法) ， 锂 ( 或钠 ) 盐丙酮 法和钡 盐苯 法， 特别是含 5 水份丙酮或 乙醇 中。其中钠盐和锂盐 法应用 最多 ， 浓缩 后， EP A 和 DHA 的 含 量 可 达 7 0 7 5 【 2 ， 5 。 2 3层析法 Ag NO 能 与多 不饱和 脂肪 酸形成 可逆 性极 强的化 合物 ， 采用 Ag NO。 硅 胶柱 层 析所 得 E P A 和 DHA 含量 在 9 0 以 上 ， 可获 得一 定量 的产 品 ， 比较 经 济实 用 ， 但存 有 洗脱 剂安 全 性 差 ， Ag 易污染 制品 ， A g NO。 不能再 生等缺 点 ， 且不宜 大规 模 生产 2 5 _ 。 日本研制 对流式 萃取塔 ( 卡 尔柱式 萃取塔 ) ， 试 验 结果证实 可 以有 效提取 DHA 乙酯 ， 其 纯度 为 9 5 ， 并可 以分 批、 间隙式生产 ， 得率也较 高【 。 2 4高效液相色谱法 此 法是 通 过 逆 相 分 配 法进 行 分 离 ， 原 理 是 根 据 E P A 和 DHA 以及其 他脂肪 酸在流 动相和 固定相 中的分 配系数 不同 ， 国 内外有关 高效液相 色谱法分 离制 取鱼油 中 E P A 和 DHA 的 研 究 不 多 见。 王 学 彤 等 曾采 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 ， 以 la - B o n d a p a k C 作 固定 相 ， CH。 OH T HF H O 作 流 动 相 ， 对 DHA 和 E P A进 行分 离纯化 ， 制备 溶液经 减压蒸馏 ， 乙酸 乙酯 萃 取 后， E P A 和 DHA 的 舍 量 分 别 可 达9 8 和 8 6 以 上 2 0 ： 日本资生堂 ( 株) 开发利用球状 银粘土 作填充剂 ， 以超 临 界一液相色谱法 高度浓 缩 DHA， 它 不需要进行分段浓缩 ， 而是 一 次性将 DHA含量浓缩 到 9 9 以上【 1 9 ， 2 0 。 2 5超临界 CO 萃取法 该方法是 一种新的分离技 术， 是用 经高度压缩 的超临界气 体 ， 取代常用 的液体溶媒 ， 并通 过调 节温度和压力使 溶解物质 的 溶解 度发生 大幅 度变化 而达 到 目的。为 了增加 溶解 度和选择 性 ， 还 可添 加些辅助溶剂 ， 如 Ms s o n发现超临界 CO 中添 加乙 醇后 ， 所有脂 肪酸在超 临界 C O 中的溶解度 得以提高 ， 组分选 择性有所下降【 2 。 2 6其他综合技术 如 医学 及某 种特 殊 需要 ， 必 须制 取 高纯 度 DHA 和 E P A ( 含量 9 0 以上 ) ， 需结合多种方法来完成。 日本 利用分 子蒸馏 法与 分段液相 色谱 法相结 合， 高度浓缩 DHA， 于 1 9 9 3年 生产 出 DHA 纯度 9 8 以上 DHA 乙酯。 日本化学饲料 ( 株 ) 将 金 枪鱼精制 鱼油经 乙酯化后， 用尿 素包合法分离得到浓度为 6 5 DHA 乙酯 ， 再经硝酸银柱层析法得到纯度为 9 3 DHA。 3存 在 的 问题 随着 对多不饱和 脂肪酸研 究深化 ， 对 DHA 需求 量也与 日 俱增 ， DHA 是 一种很 有市场前 景 的产品。在 目前还缺 乏提供 廉价纯 DHA 大规模 生产技术 的情 况下 ， 利用微 生物 发酵 生产 DHA 的研 究确已取得一定 进展 ， 但还 存在 以下 问题 ：( 1 ) 缺 乏 高产 DHA的优 质菌种 ， 在发酵过程中菌体生长速率低 其 脂质 含量和 DHA 含量不高。( 2 ) DHA微 生物 发酵研究大多停 留在 实验室的摇瓶培养阶段 ， 没 有大规模实现工业化生产。( 3 ) 从微 生物发酵 液中提取 DHA 方法还 有待于进 一步改进 ， 以适应 于 工业 化生产需要。( 4 ) 尚需探索微 生物可利用 的廉 价底物 ， 以降 低其 生产成 本。因此 当前最迫切 的任务是从 自然界微生物资源 中筛选高产 DHA 的优质菌种 ， 加强对 DHA发酵条件 、 代谢调 控和提取工 艺的研 究。 参考文献 1狄济 乐 EP A 和 DHA 的研 究和 进展 【 J 】 l 四川 粮油 科技 ， 1 9 9 7 ( 1 1 ： 2 9 3 2 2洪滨 ， 刘 会洲 EP A 和 DHA 研究 现状 及 发展趋 势 【 J 】 _ 化工 治 金 ， 1 9 9 6 1 7 ( 1 ) ： 8 0 8 5 3 马 亭 ， 陈 文 锐 ， 等 深 海 鱼 油 中脂 肪 酸 的 分 析 【 J 】 分析 化学 ， 1 9 9 9 2 7 ( 4 ) ：4 1 5 41 8 4徐 天 宇 利 用 生物 技 术 生 产廿 二 碳 六烯 酸 【 J 】 食 品与 发 酵 工 业 ， 1 9 9 5 ， 21 ( 1 ) ： 5 6 6 5 5 吴 克 刚 ， 等 真 菌 发 酵 生 产 鱼 油 特 征 脂 肪 酸 【 J 】 l 微 生 物 学 杂 志 ， 2 0 0 1 ， 2 1 ( 2 1 ： 4 5 4 7 6B a j p a i PB p a i P K W a r d O P P r o d u c t i o n o f DHA b y T h r u s t o c h y t r i u m a u r e u m 【 J 】 l Ap p l M i c r o b i o l B i o t e c h n o l ， 1 9 91 35 ： 7 05 71 0 7上原健 一， 坂冢时男， 武 内大造 海洋性微细藻类的培养方法 【 P 】 J P P a t e n t【 0 7 8 9 ， 9 6 0 ， 1 9 9 5 8Ha r wo o d J L _Ru s s e l l N J L i p i d s i n P l a n t s a n d M i c r o b e s 【 M】 Lo n d o n ： Ge o r g e Al l e n a n d Un wi n ，l 9 8 4 ： 3 5 8 - 3 6 2 9Ba j p a i P K Ba j p a i P W a r d O P Op t i mi z a t i o n o f p r o d u c - t i o n o f DHA b y Th r u s t o c h y t r i u m a u r e u m ATCC3 4 3 0 4 【 J 】 J A m Oi l Che m S oc 1 9 91 ： 7 ： 5 0 9 51 4 1 0 Ra t l e d g d CMi c r b i a l L i p i d s【 M】 v o l 2 Lo n d o n ： Aa c a d e mi c pr e s s ， l 98 9 1 1 Er wi n J L i p i d s a n d Bi o me mb r a n e s o f F u n g i a n d Ot h e r Or - g a a n i s m 【 M】 Ne w Yo r k ： P l e n u m P r e s s ，l 9 7 3 1 2 We e t e J DKi m H Ga n d h i S R e t a 1 L i p i d s a n d Ul t r a s t r u c t u r e o f T h r a u s t o c h y t r i u m s p ATCC2 6 l 8 5 【 J 】 Li p i d s ， 1 9 97 ， 8： 8 3 9 - 8 4 5 1 3 S i n g h AWi l s o n S Wa r d OPDo c o s a h e x a e n o i c a c i d Pr o - d u c t i o n b y Th r a u s t o c h y t r i u m s p ATCC2 0 8 9 2【 J 】 W o r l d J M i c r obi ol Bi ot e e c h 1 9 9 6 ；1 2： 7 6 8 1 1 4 Na k a h a r a TYo k o c h i T Hi g a s h i h a r a Te t a 1 P r o d u c t i o n o f DH A b y S c hi a oc hy t r i u m s pi s ol a t e d f r om Yap i s l a nds 【 J 】 J Am Oi l Ch e m S o c 1 9 9 6 ； l 1 ： l 4 2 l l 4 2 6 1 5 S h i mi z