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河北农业科学, 2009, 13 (12) : 35 - 36, 42 Journal of HebeiAgricultural Sciences 编辑 索相敏 纤维素酶发酵工艺的研究进展 曾青兰,王志勇 (咸宁职业技术学院,湖北 咸宁 437100) 摘要:综述了纤维素酶发酵生产的主要菌种、发酵培养基、固态发酵工艺和液态深层发酵工艺。展望了纤维素 酶发酵生产的前景。 关键词:纤维素酶;发酵工艺;固态发酵;液态深层发酵 中图分类号:TQ92011 文献标识码: A 文章编号: 100821631 (2009) 1220035202 Advances in Fermentation Technology of Cellulase ZENG Qing2lan, WANG Zhi2yong (XianningVocational Technical College, Xianning 437100, China) Abstract: The strains,fermentation media,solid state fermentation technology and liquid deep layer fermentation technology of cellulase produced by fermentation were summarized1The prospectwas forecasted1 Key words: Cellulase;Fermentation technology;Solid state fermentation; Liquid deep layer fermentation 收稿日期: 2009212204 基金项目:湖北省教育科学 “ 十一五 ”规划专项资助(2008B152) 作者简介:曾青兰(1965 - ) ,女,湖北咸宁人,硕士,副教授,主 要从事酶分子进化工程的研究。 纤维素酶是指能水解纤维素 2104葡萄糖苷键,将 纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。纤维 素酶的研究开发是利用新世纪的可再生资源 纤维素 的关键,是缓解人类当前面临的 “ 粮食、能源、环境 ” 三大危机,实现农业可持续发展的有效途径之一。为了 提高纤维素酶的产率、更好地利用纤维素,愈来愈多的 国内外学者开始关注纤维素酶的发酵生产,纤维素酶的 发酵工艺水平不断改进,生产效益和经济效益也不断提高。 1 纤维素酶发酵生产的主要菌种 微生物是自然界中产纤维素酶的主要生物体。但细 菌所产纤维素酶多为胞内酶,产量较低,在工业上应用 得较少。真菌产生的纤维素酶多为胞外酶,提取纯化较 容易,产酶量较高,且真菌所产纤维素酶的酶系结构较 全,酶系中的各种酶相互发生强烈的协同作用,降解纤 维素的效率高,是工业生产的主要菌种。如里氏木酶 (Trichoder mareesei)和 绿 色 木 霉(Trichoder maviride Pers1ex F r1)等是目前公认的较好的纤维素酶生产 菌 1 。优良的诱变菌种 ,是纤维素酶发酵生产菌的另一 来源。韩峰等 2 以拟康氏木霉 (Trichoder ma pseudokon2 ingii)TH为出发菌株,采用紫外诱变获得1株抗高浓 度葡萄糖阻遏突变株UV,纤维素酶产量显著提高。 UV 对诱导物的敏感性增加了100倍,并且对葡萄糖 的吸收能力明显下降,使得该菌解除了部分葡萄糖的阻 遏作用。随着现代分子生物学技术的发展,基因工程菌 也成为了纤维素酶发酵生产菌的来源之一,如汤新等 3 构建的工程菌P1pastoris EG1,在甲醇诱导下,可以 合成并分泌EG, CMC活力达到2111U /mL。 纤维素酶发酵生产的重点之一是将2种以上产酶微 生物一起接种进行混合发酵,利用它们所产各纤维素酶 系的互补作用,生产出优质高效的混合纤维素酶。 2 纤维素酶发酵生产的培养基 纤维素酶是诱导酶,其生物合成的调控受诱导物的 约束。通常采用经过粉粹并预处理的富含植物纤维原 料、废纸、各种酒糟等作为诱导物和主要碳源,添加适 宜的氮源和无机盐等。瓮佩芳等 4 在啤酒糟中添加 15%麸皮、2%尿素、1%硫酸铵和0115%的KH2PO4, 可以明显提高产物的酶活力和蛋白含量。进行液态发酵 时,另外需要将物料与过量的水配成液体培养基,多数 研究者采用干物料占液体培养基3%的用量 5 。余晓斌 等 6 用响应面法对里氏木霉 WX2112液体发酵产纤维素 酶的培养基进行了优化,通过岭脊分析,确定了滤纸酶 活达最大值10153 I U /mL时的最佳组合条件:豆饼粉 3118% ,麸皮2195% , KH2PO40125% , Avicel 3179%。 3 纤维素酶固体发酵工艺 311 固体发酵工艺 31111 固体发酵工艺特点 固体发酵法又称麸曲培养 法,是以秸秆粉、废纸、玉米秸秆粉为主要原料,拌入 种曲后,装入盘或帘子上,摊成薄层(厚约1 cm) ,在 培养室一定温度和湿度(RH 90%100% )下进行发 酵。其主要特点是发酵体系没有游离水存在,微生物是 在有足够湿度的固态底物上进行反应,发酵环境接近于 自然状态下的微生物生长习性,产生的酶系更全,有利 于降解天然纤维素,且投资低、能耗低、产量高、操作 简易、回收率高、无泡沫、需控参数少、环境污染小 等。但固体发酵法易被杂菌污染,生产的纤维素酶分离 纯化较难,且色素不易去除。 31112 固体发酵设备 浅盘发酵器是比较常用的一种 河北农业科学2009年 固态发酵设备,培养基经灭菌冷却后装入浅盘,通过空 气增湿器调节空间的温湿度进行发酵,工业化程度较 低。固体发酵设备发展的趋向是机械化发酵罐,尤其是 流化床式固体发酵设备,发酵效果将更好 7 。 31113 固体发酵工艺流程 斜面试管 小三角瓶培养 大三角瓶培养 种子罐培养 原料 (稻草等) 粉碎 配料 (麸皮、营养盐等) 混合 蒸煮灭菌 冷却接种 成品 包装 干燥 过滤 盐析 浓缩 过滤 浸提 固体发酵 31114 固体发酵工艺条件 固体发酵过程中的温度、 湿度、时间、水分、pH值等因素及其交互作用对发酵 有显著影响,对固态发酵而言,温度是首要因素。培养 基及培养条件的优化,是降低酶制剂成本、提高酶活、 实现其工业化生产的重要措施。一般认为利用真菌进行 固态发酵最好将培养基的起始pH值调为酸性,这样有 利于真菌的生长而抑制细菌的滋生。固态发酵培养基的 初始含水量,应视纤维素材料种类不同而异。玉米秸秆 培养基适宜的含水量为1 (2 21 5) (w/w) ,麦秸培养 基适宜的含水量为1 (1 115) ,啤酒糟培养基的含水 量为11 8 。靖德兵等9 采用均匀设计 U15 (58)和双 温度培养法(前30 h恒温30,后续恒温27)进行 康氏木霉产酶固体发酵生产纤维素酶条件的研究,结果 表明,应用双温度培养法进行康氏木霉固体发酵生产纤 维素酶时,在自然补给氧气、培养基pH值自然(约 61 5) 并保持环境湿度约60%的条件下, 72 h是适宜的 发酵周期。徐福建等 10 提出了纤维素酶气相双动态固 态发酵的方式:在优化条件下(最佳压力脉冲范围、脉 冲频率及气体内循环速率 ) , 发酵温度得到较好地控制, 910 cm高的填料层中最大温度梯度为0112/cm;以汽 爆秸秆为底物,发酵水活度得到较好的保持;动态培养 发酵周期(60 h)比静态发酵周期(84 h)缩短了1/3, 酶活(20 136 I U /g)比静态酶活(10 182 I U /g)提高了 1倍,压力脉动固态培养的料层上中下微生物生长状况 均匀一致且疏松,而静态固态发酵的料层中部几乎没有 菌体生长。利用气相双动态固态发酵可为纤维素酶大规 模生产奠定基础。 4 纤维素酶液态深层发酵工艺 411 液态深层发酵工艺特点 液态深层发酵又称全面发酵,是将秸秆等原料粉 碎、预处理并灭菌后送至具有搅拌桨叶和通气系统的密 闭发酵罐内,接入菌种,借强大的无菌空气或自吸的气 流进行充分搅拌,使气、液面积尽量加大而进行发酵。 其主要特点是培养条件容易控制,不易染杂菌,生产效 率高。液态深层发酵是现代生物技术之一,已成为国内 外重要的研究和开发工艺。 412 液态深层发酵设备 液态深层发酵一般采用具有搅拌桨叶和通气系统的 密闭发酵罐,从培养基的灭菌、冷却到发酵都在同一发 酵罐内进行。 413 液态深层发酵工艺流程 斜面试管 小三角瓶培养 大三角瓶培养 种子罐培养 原料 (稻草等) 粉碎 配料 (麸皮、营养盐等) 混合 蒸煮灭菌 冷却接种 成品 包装 喷雾干燥 超滤浓缩 压滤 液体深层发酵 414 液体深层发酵工艺条件 液体发酵时间约为70 h,温度一般低于60。液 态发酵中使用的接种量明显低于固态发酵,其接种量浓 度一般为2%10%(v/v)。张冬艳等 11 研究了绿色木 霉A S1313711、康宁木霉A S1312774、木霉A S1313032 和康宁木霉ACC131167的适宜发酵产酶条件,结果表 明,最适温度为28,产酶适宜的起始pH值为415 515。曾青兰等 12 对丝状真菌菌株 Gibberella f uj ikuroi产 纤维素酶的条件进行了研究,结果表明,接种量为 5%、培养时间为120 h、培养温度为2837、培养 基初始pH值为56时,产酶可以达最佳值。 5 纤维素酶发酵生产的前景 21世纪是可持续发展的世纪,随着人们对纤维素 酶研究工作的深入,必将研制出更为有效的纤维素酶发 酵生产的新工艺,较好地解决纤维素的生物转化问题, 从而切实地缓解人类当前面临的 “ 粮食、能源、环境 ” 3大危机。纤维素酶的工业化发酵生产必将成为大有发 展前途的新兴工业产业之一。 参考文献: 1 Bhat M K1Cellulases and related enzymes in biotechnology J .BiotechnolAdv, 2000, 18 (5) : 355 - 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