纤维素酶在酱油酿造上的应用研究.pdf

第 9 期 2 0 0 8年 9月 中国调味品 CHI NA CoNDI M ENT NO 9 Se pt 20 0 8 纤维素酶在酱油酿造上 的应用研究 史龙君 ( 哈尔 滨正 阳河调 味食 品有 限公 司 ， 哈尔滨1 5 0 0 7 6 ) 摘要 ： 纤维素酶用于酿造酱油中， 强化了原组织结构的破裂， 使蛋 白质裸露， 利于蛋 白酶对蛋 白 质 的分解， 提 高了酱油的出品率， 加快了发酵速度， 从而使酱油中的还原糖、 色度及全氮利用率 均有 显著 的提 高。 关键词： 纤维素酶； 米曲霉( 沪酿 3 0 4 2 ) ； 蛋 白质裸露； 酱油出品率 中 图分类号 ： TS 2 6 4 2 1 文献标 识码 ： B 文 章编 号 ： 1 0 0 0 9 9 7 3 ( 2 0 0 8 ) 0 9 0 0 6 1 0 4 Th e r e s e ar c h i n g o f c el l u l a s e i n s o y br ewi n g S HI Lo n g - j u n ( Ha r b i n Z h e n g y a n g h e L i mi t e d F o o d S e a s o n i n g ， Ha r b i n 1 5 0 0 1 0， Ch i n a ) Abs t r a c t ： Appl i c a t i o n of c e l l ul a s e i n s o y s a uc e br e wi n g，s t r e n gt he ni n g t he r up t ur e o f t he mi c r os t r uc t ur e， m a ke t he p r ot e i n b a r e d，ma ke i t e a s y t o p r o t e i n de gr a d a t i o n， i nc r e a s i ng t he ut i l i z a t i o n o f t h e ma t e r i a l a n d t h e s p e e d o f t h e f e r me n t a t i o n ，i n o r d e r t o i n c r e a s e t h e r e d u c i n g s u g a r ，c h r o ma a n d t h e t o t a l n i t r o g e n Ke y wo r d s ：c e l l u l a s e ； a s p e r g i l l u s o r y z a e ； t h e p r o t e i n b a r e d； s o y s a u c e o f c a s t i n g 酱油是大豆蛋 白酶水解产物。在酶解过程中 伴有一系列的发酵过程 ， 为酱油增添了特有的香 气及风味。酱油的酿造需极强的蛋白酶活力， 为 使大豆蛋白酶从组织中充分裸露， 又需植物崩裂 酶活力( 果胶酶、 半纤维素酶、 纤维素酶等) 。现生 产使用的米曲酶 3 0 4 2 #菌株， 植物崩裂酶 系活力 不 足 ， 添 加 了 纤 维 素 酶后 ， 蛋 白利 用 率 有 明 显 提 高 。 1 材料与方法 1 1 材 料 菌种 ： 米曲霉 3 0 4 2 #， 哈尔滨正阳河调味食 品有 限公 司生产 菌种 。 纤 维素 酶 ： 黑 龙江 省万力 达集 团公 司提供 ( 工 业 级 ) 。 酸性蛋 白酶 ： 无锡酶制剂厂。 豆粕、 麸皮等原料均为哈尔滨正阳河调味食 品有限公司生产用料。 收稿 E l 期 ： 2 O O 8 一O 4 1 3 1 2方法 1 2 1工艺 流程 3 0 4 2 #种 曲接 1 种 量 O 3 苎 翌 6 o 混 辩 一 + 加 水 _ + _ + 制 曲 - + 成 曲 _ + 混 合 - + 拌 水 _ 人 池 麸 皮 t 纤 素酶 盐柜 二 油 水 t l 一 发酵一成 熟酱醅一 第一次淋 油一第二 次淋油一 第三 次淋油一 酱渣 I I + 固 _无 盐 发酵 头 L 一 三 油 调配 I 成品油 1 2 2 埋池操作 人池前取出 1 O k g成曲， 加 2 5 k g 8 0 9 0 热水 ， 按 比例加入 纤维 素酶 ， 混匀 ， 装入 塑料 桶 内 ， 加盐 ， 埋入酱池 ， 盖不漏 出盐层。发酵 4 d后 ， 将 桶取出， 加 2 7 k g二淋浸油 ， 放入池中保温 1 d后 全部装入布袋， 放于底板有小孔的木板筐内， 加重 力压油 ， 计量并测定压出油的各项指标 。 对 照同 维普资讯 6 2 中 国 调 味 品 总第 3 5 5 期 上述操作 ， 但不加纤维素酶 。 1 2 3 生产中试验的操作 按 比例将纤维素酶制剂放人池前同成曲混合 均匀 ， 其他操作均同正常生产。 1 2 4 检 测方法 1 2 4 1 纤维素 酶活力 检测 酶液 的制备 ： 准 确称 取 1 0 0 mg纤 维素 酶 ， 溶 解后 定容 至 1 0 0 mL容 量 瓶 中 ， 则 此酶 液 浓 度 为 1 mg mL。 绘 制 标 准 曲 线 ： 分 别 取 标 准 葡 萄 糖 液 ( 1 mg mL ) ( O ， 0 1 ， 0 2， 0 4， 0 6， 0 8， 1 0 ， 1 2 ) 2 O mL比色管 中， 以蒸 馏水 补足 至 2 mL， 加 DNS试 剂 1 5 mL ( 3 ， 5二硝基水 杨酸 ) 。混匀后 ， 在沸 水浴煮 沸 5 mi n ， 冷却 后定 容至 2 O mL， 摇 匀 。 以 1号管调零， 于 5 4 0 n m波长测 OD值。制标准 曲线 。 样品测定 ： 取 3支 2 0 mL刻度 比色管， 分别 依次加 0 5 mL酶液 ， 1 5 mL 0 0 5 M 柠檬酸缓冲 液 ( p H5 O ) ， 5 0 mg滤纸 条 ( 新 华 定量 滤 纸约 1 6 c m) 。在其 中的一支 比色管 中立 即加 1 5 mL D NS试剂， 终止酶 作用， 作为空 白与另外两支 比 色管一起在 6 O水浴中保温 1 h ， 取出后在后两 支比色管中各加 1 5 mL D S N， 然后一起在沸水 浴煮 5 mi n ， 冷却后定 容至 2 O mL于 5 4 0 n m 比 色， 以空白调零点， 测 OD值 。 计算 ： 以每 小时 由底物产 生 1,u mo l 葡萄糖 所 需的酶量定义为一个酶活力单位。 酶活力( l mo l gh ) 一葡萄糖生成量 n X 5 5 6。 n ： 稀释倍数 5 5 6： 1 mL葡萄糖换算成 mo l 数 1 2 4 2 成熟酱醅的氨基酸态氮和酱油的全氮、 氨基酸态氮， 还 原糖均按 Z B x 6 6 0 1 3 8 7的标准执 行 ， 色度按 S B 7 4 - 7 8标准执行。 2 研 究结果 2 1 对 纤维 素酶 制剂有 关性能 的检测 本研究是直接把纤维素酶制剂用 于酱油 生 产 ， 以期 提高酱油的原 料出油率和蛋 白利用率 。 为利于使用 ， 对以下几点特性进行了检测。 2 1 1 纤维素酶制剂活力测定 酶 制剂 滤纸 酶活力 标准 为 2 0 0 0 单 位 g ， 试验 用 酶的 活力结果 见表 1 。 表 1 酶制剂滤纸酶活 力标准为 2 0 0 0单位 g 试验用酶的活 力结 果 l 2 2 5 4 1 8l 8 l 5 4 9 l 04 9 2 1 9 46 1 5 9 9 1 5 1 6 l 1 1 0 3 2 5 3 4 l 9 4 6 1 4 4 4 1 O 6 3 4 l 8 7 0 1 7 4 3 1 4 8 7 U 9 6 5 2 3 6 6 1 5 4 5 1 1 9 3 6 一 一 1 3 8 3 1 4 l 7 7 一 一 1 4 2 6 l 3l 1 平均 2 1 9 5 1 7 7 3 1 4 7 8 1 1 9 1 从 上表可 以表看 出 ， 随着酶浓 度递减 ， 酶 活力 递增 。 国际理 论 和 应 用 化 学 协会 ( I UP AC ) 发 酵 委员会 制定 了木 霉纤 维 素 酶 系 的检 测方 法 ， 以便 于酶活力的比较， 该方法确定在测定滤纸酶活力 时 ， 酶液 的稀 释 度 应 控 制 在 反 映 物 达 到 2 0 mg 葡 萄糖 。 2 1 2热稳定性 试验 酶对 温度极 为敏感 ， 随着 温度 升高 ， 酶促 反应 速度显著提高。霉本质是一种蛋 白质， 温 度过高 就会变性失活。各种酶的失活温度有所不同。固 态无盐发酵主产酱油 ， 发酵温度高达 5 O 6 O， 最高不超过6 O。本试验以在一定酶浓度下， 置 5 O ， 5 5 ， 6 O， 观 察酶 活力保持 情况 ， 结果 见表 2 。 表 2 一定酶浓度下酶活力保持情 况结 果 由表 2可知 ， 随着温度升高， 该酶活力损失加 快 ， 5 0酶活力可保持 2 4 h不变， 在 5 5， 2 4 h 损失 5 5 ， 6 O， 4 h即损失 5 6 ， 8 h即完全失 活 。 滤纸酶活力测定按如下方法进行。 酶液的制备 ： 将酶粉稀释至 0 5 备用。 标准曲线的绘制 ： 取标准葡萄糖( 1 mg mL) 0 ， 0 1 ， 0 2 ， 0 4 ， 0 6 ， 0 8 ， 1 0 mL于 2 5 mL 比色 管 中 ， 以蒸馏 水补 足至 1 mL， 加 D NS试 剂 3 mL， 维普资讯 第 9期 试验研 究 纤 维素酶在 酱 油酿造上 的应 用研 究 6 3 混匀 后 于沸水 浴 中煮 沸 5 rai n ， 冷却后 定 容至 2 5 mL， 摇 匀 ， 以 1号 管 调零 于 5 3 0 D m 处 测 0 D 值 ， 绘制标准曲线。 样 品测定 ： 取 两支试 管 。0 5 mL酶液 加 1 5 mL( p H5 O ) 柠 檬 酸 缓 冲 液 ， 加 入 5 0 mg滤 纸 条 ( 约 1 6 c m) 。空 白以0 5 mL 蒸馏水代替上述酶 液 ， 其他不变。分别于 5 O ， 5 5 ， 6 O保 温 1 h后 ， 取 出 1 mL酶反应液， 分别加入 3 mL D NS ( 3 ， 5 - - 硝基水杨酸) 煮沸 5 rai n ， 冷却后定容至2 5 mL， 于 5 3 0 n m 处 测定 oD值 。 计 算 ： 酶活力 ( mo l g h ) 一5 5 6 X n 。 注 ： 酶活力单位以每小 时由底物产 l mo l 葡 萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。 2 2生产 性小型 埋池试 验 为了更 好 的贴 近 生产 实 际 条件 ， 使 小 型 实验 所 得数 据更 可靠 ， 经过 反复讨 论 ， 提 出了埋 池发 酵 法 ( 具体 操 作 见 1 1 ) 。做 了不 同加 酶 量 ， 改 变下 池 拌水 比例 ， 补加 酸性蛋 白酶 等试 验 ， 经过 十多 次 试验， 肯定了添加纤维素酶制剂的生产效果 。 2 2 1 不 同加酶 量试验 不 同加 酶量 对酱油 出品率 的影 响见表 3 。 表 3 不 同加 酶 量 对 酱 油 出品 率 的 影 响 加入纤维素酶的成熟酱醅， 色深 ， 手感柔软， 不同于 对 照。酱 油 各 项 指 标 如 表 3所 示， 加 1 2 5 纤维素酶可提高出油率 9 2 。霉活减低 到 0 1 2 5 ， 仍可见良好效果 。 2 2 2 稳 定试 验 采用 1 2 5 加纤 维素 酶量 ， 连续进 行 了七 批 次埋池试验 ， 以检验上述试验所得结果可靠性。 从以下结果可看出在粮食出油率 ， 加快发酵速度 ， 提高酱油中的还原糖 以及增加酱油色度均有明显 效果 。 2 2 2 1 提高 粮食 出油 率 尽管各批次酱醅 的消化率 、 蛋 白酶活力有高 有低 ， 但加酶的成熟酱醅都具有色泽较深， 手感柔 软的特点 ， 折成标准二级油各批次出油率都高于 对 照 ， 平 均提高 5 5 V oo 。结果 见表 4 。 表 4 折成标准二级油各批次 出油率 批次 出油量 粮食出油率( ) 对照( 0 5 k g ) 试验 对照 试验 5 6 O O 5 3 7 5 5 7 8 5 5 5 2 5 5 3 O O 5 7 8 0 5 4 5 0 5 5 4 5 2 2 2 2 加快 发酵 速度 加纤维素酶， 加速 了氨基酸氮 的生成 ， 发酵 7 2 h的酱醅的氨基酸氮 比对照样高 出 6 ， 接近 发 酵 9 6 h的对 照样 ， 结果见 表 5 。 表 5 氨基酸氮的生成与对照样的比较结果 2 2 2 3 提高酱油 中还原糖 纤维素酶的加入， 同样有利于淀粉的释放 ， 便 于淀粉酶对淀粉的作用。发酵 7 2 h ， 酱油 中糖 比 对 照提 高 1 0 9 ， 发酵 9 6 h ， 比对 照提 高 1 7 1 。 结 果见 表 6 。 表 6 纤维素酶的加入对淀粉 的释放作 用 批次 发酵 7 2 h 发酵 9 6 h 对照 试验 对照 试验 3 9 0 3 5 5 2 7 2 3 1 9 2 3 3 2 9 9 2 1 5 3 Ol 2 9 8 4 1 5 3 7 5 3 4 2 4 O 5 2 5 6 3 6 O 2 8 O 3 6 O 3 4 9 5 6 5 1 9 O0 l n弘 。 。 船 一 一 一 2 5 2 2 3 3 一 一 一 。 维普资讯 6 4 中 国 调 味品 总第 3 5 5期 2 2 2 4 增 加酱油 的色 度 加纤维素酶的酱油还原糖、 氨基 酸氮都有所 提高， 有利于美拉德反应的进行 ， 所以酱油色泽都 有提高 。结果见表 7 。 表 7 加纤维素酶的酱油 色泽对照 2 3 生产 性试 验 小型埋池试验严格来说只是定性试验， 通过 对照和试验样品所得的数据的 比较 ， 确定加入纤 维素酶制剂对酱醅发酵的影响， 是否可提高粮食 出油率， 提高蛋 白利用率以及对酱油风味的影响。 小型埋池试验同生产的差异 ， 表现在规模、 淋油的 不同方式 ， 小型埋池试验采用了压榨出油， 而生产 则 采用原 池浸油 工艺 。埋池 试验在 发酵完毕 加二 淋水浸油， 在装袋时起到使浸水 和酱醅搅拌混合 的作用 ， 利于醅 内有效成分进入酱油。当酱醅较 粘时， 这种搅和尤为有利。淋油是靠酱醅 内含 的 有效成分和淋水之间的浓度差 ， 逐步由高浓度向 低浓度扩散入浸水 ， 成为酱油。当酱醅粘度增加 时， 扩散 速度减慢 。加纤维素酶的酱醅柔软、 较 粘， 采用压油工艺较为有利。采用淋油工艺， 若浸 油时间不足 ， 酱渣可能会带走部分氨基酸等有效 成分。为适应生产 中正使用的原池浸油工艺， 必 须考虑这一情况 ， 适当减少纤维素酶用量， 降低酱 醅粘稠度 ， 既要发挥纤维素酶破坏原料细胞组织 结构 ， 使蛋 白质裸露， 帮助蛋 白酶 的作用， 以提高 出油率， 又不能影响淋油的得率。 2 3 1 不 同加 酶量对 浸油 和 出油 的影响 在小型埋池试验的基础上 ， 结合生产确定 了 纤维素酶的加量 。在实验的过程中， 发现加入纤 维素酶后 ， 出油率有较大幅度提高 ， 但头淋油效果 下降， 假如纤维素酶量越大 ， 头淋油效率越低。结 果见 表 8 。 媳 量 藤 油 (T) ( ) 油 (T) ( ) 油 (T) ( ) 由上表可知 ， 加 0 1 2 5 纤维素酶的酱油一淋油 占总出油量的 5 8 7 ， 加 0 0 1 2 5 纤维素酶一淋油 占总出油率量上升到 7 3 7 ， 对照却为 8 2 1 ， 由上 述百分率可清晰看到，