免疫组化2-基本原理.pptVIP

免疫组织化学技术,抗原抗体（特异性）标记物，原位显示组织或细胞内抗原的一门技术。,根据抗体标记物不同： 酶-免疫酶组织化学 荧光素-免疫荧光组化 胶体金-免疫胶体金组化 高亲和力物质-亲和免疫组化,其中，免疫酶组织化学应用广泛 以其为例，掌握免疫组化基本原理,免疫酶组化特点： 信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广,酶选择标准： 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。, 酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。,酶在PH中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。,符合上述条件： 辣根过氧化物酶-HRP 硷性磷酸酶-AKP 葡萄糖氧化酶-GOD,（一）辣根过氧化物酶（HRP） 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性, 可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色 HRP穿透力强，易进入细胞内,HRP的底物：低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。,HRP显色反应： HRPH2O2 HRPH2O电子供体（氧化型）,电子供体,电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。,HRP常用的电子供体： 3.3-二氨基联苯胺(DAB)棕色 氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。,4-氯-1-茶酚（4CN）蓝色，易弥散，不能久保存 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) 黄色,（二）硷性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制作用,AKP底物： AKP常用的底物为-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB蓝色 固红TR红色,（三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性GOD 分子量大，穿透力较弱,第一节 基 本 原 理,酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。,一、酶标记抗体法,直接法,（一）直接法,原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原-抗体 HRP复合物,步骤：一步完成 优点：简便、省时 特异性强，非特异染色轻 缺点：敏感性差 一种标记抗体只能检测一种抗原,组织抗原,第一抗原,第二抗体,过氧化物酶,间接法,（二）间接法,原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原-特异性抗体-第 二抗体 HRP复合物,优点：较直接法敏感性高 一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原 缺点： 较直接法费时 非特异性染色稍重,步骤：二步法, 制备抗酶抗体 制备PAP复合物,酶桥法,组织抗原,第一抗体,第二抗体,第三抗体（抗酶抗体）,HRP,二、酶桥法,原理：HRP标记在抗酶抗体（三抗）上， 抗原-特异性抗体-第 二抗体-第三抗体 HRP复合物,一抗、三抗有何关系？,优点：与酶标记抗体法相比，敏感性高 （酶与三抗通过抗原-抗体反应 结合，避免直接标记引起两者活性降低） 缺点： 较费时,步骤：四步法,一、PAP法 原理：抗原-特异性抗体-第 二抗体（桥抗体）- PAP复合物,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,HRP,三、PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法）,原理：与酶桥法相似，不同之处是将酶与三抗制备成PAP复合物。 抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗）-PAP复合物,优点：敏感性较高 背景染色较轻 局限：特异性抗体与PAP必须为同一种属动物,步骤：三步法,APAAP法（碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物法）,原理：抗原-特异抗体-二抗- APAAP复合物,优点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰 缺点：产物易溶于有机溶剂,步骤：三步法,四、双PAP法,原理：在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物 抗原-特异性抗体-二抗（桥抗）-PAP -二抗- PAP复合物,步骤：五步法 优点：敏感性较高 缺点：步骤多，费时 非特异性背景重,Avidin-一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成 Biotin-小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力，比普通抗原抗体亲和力高百万倍以上,五、亲和免疫组化,组织抗原,第一抗体,第二抗体,HRP,生物素,亲和素,原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin,（一 ）ABC法 (Avidin -Biotin peroxidase-Complex method),酶素化BiotinAvidin- ABC复合物 抗原-特异抗体- Biotin标记二抗- Avidin Biotin HRP,步骤：三步法 优点：敏感性较高 特异性强 应用范围广 缺点：某些脏器存在内源性生物素干扰 Avidin与糖基、纤维组织、核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应,（二）SABC法（Streptavidin biotin Peroxidase Complex） 比较亲和素，链霉亲和素造成的背景着色浅 SABC法已代替ABC法,（三）LSAB法（ Labelled Streptavidin Biotin Method）-又称链霉亲和素-过氧化物酶法（SP法）,原理： Biotin标记第二抗体 HRP标记Avidin,抗原-特异性抗体-Biotin标记第二抗体-Avidin HRP复合物,步骤：三步法 优点：敏感性高 特异性强，背景浅淡 方法简便,六、多聚合物酶法,组织抗原,一抗,HRP,多聚骨架,（一）Epos法（Enhanced polymer one-step staining）,原理：采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成HRP-多聚合物-特异性 抗体。,步骤：一步法 优点：快速，简便，特异性强， 敏感性高 缺点：商品化种类不全， 价格昂贵,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚骨架,第一步,第二步,（二）EnVision法（E