DNA多态性分型技术四川大学讲义.ppt

第三节 DNA多态性分型技术,四川大学华西公共卫生学院 张薇薇,Email: . Q Q: 363002530,分型技术有那些?,- 血清学分型 - 生物化学分型 - 噬菌体分型 .,传统的分型技术,分子生物学分型技术,?,- PFGE - 限制性酶切图谱分析 - PCR技术 - 质粒图谱,脉冲场凝胶电泳 pulsed-field gel electrophoresis PFGE,原 理,琼脂糖凝胶依靠不同的分子筛效应对大小不同的DNA分子进行分离。超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。 大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题,原 理,PFGE利用定时改变电场方向的交流电源，每次电流方向改变持续l s到5min左右，然后改变电流方向反复循环，故称为脉冲式交变电场。随着电场方向的交替变化，DNA分子呈“Z”形向前运动。每改变一次电场方向，大的伸展的DNA分子就必须重新定向，在新的方向上通过凝胶。重新定向所需的时间与DNA分子的长度成正比。,脉冲电场电泳示意图,（1）细菌培养 （2）制备胶块 （3）菌体裂解 （4）胶块洗涤 （5）酶切 （6）电泳 （7）结果处理,PFGE图谱获得过程,PFGE 优势,重复性好,分辨力强, 被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”,PFGE 的局限性,PFGE的优势和局限性,任何一种技术都不是完美的！,还有没有其他技术作为补充？,DNA多态性 ?分型技术?,Yes!,自然界的生物的个体差异,我是独一无二滴!,不同or 差异? 多态性（polymorphism） 定义: 是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性或基因多态性 (genetic polymorphism). 从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。,DNA多态性在微生物中的实际意义？ 将导致 不同的细菌亚型 耐药菌株出现 毒力变异株出现 抗原漂移与抗原变异 。,在疾病预防控制中的应用,同源性追踪,细菌分型,传染控制,DNA多态性分析常用的方法,限制性片段长度多态性分析技术 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性DNA分析技术 (RAPD) 细菌基因组重复序列PCR技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。,DNA多态性分析常用的方法,限制性片段长度多态性分析技术 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性DNA分析技术 (RAPD) 细菌基因组重复序列PCR技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。, 1974年首创，以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记，是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针-杂交技术的综合应用,一、限制性片段长度多态性分析 Restriction fragment length polymorphism，RFLP,因此，RFLP即是基于限制性核酸内切酶酶切消化核酸及标记的DNA探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度变异性来检测生物体多态性,基 本 原 理,每种生物基因型具有其独特的特征，及独特的限制酶识别序列分布，其基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些片段经电泳以后几乎是连续排列的，如用放射性同位素标记的DNA作探针，将与被标记的DNA相关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。,核酸分子杂交技术原理,核酸经加热变性后，在低于变性温度20 30时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段。,RFLP操作流程图,基本方法,转移电泳槽,聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术 PCR-RFLP,基本原理,结合PCR技术与RFLP技术的优点，其基本原理是对目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳后可产生不同电泳图谱，通过对电泳图谱的分析，得出基因多态性结果。,2019/8/4,四川大学华西公卫 裴晓方,26,Kary Mullis1993 年因此荣获诺贝尔化学奖,聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定DNA或RNA片段的技术。,由变性 、 退火 、 延伸三个基本步骤构成,PCR反应五要素的优化,1、多聚核苷酸引物 2、Taq DNA聚合酶 3、dNTP（三磷酸脱氧核苷酸） 4、模板核酸 5、缓冲液,基 本 程 序,1. 提取DNA 2. 设计特异引物进行目的基因PCR反应 3. 将DNA扩增产物选用合适限制性内切酶酶切 4. 将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼脂 糖凝胶上电泳分离 5. 对显示出来的带谱进行分析。,RFLP与PCR-RFLP的应用,结核分枝杆菌IS6110-RFLP分析 厌氧菌16SrRNA基因PCR-RFLP分析 其他,我的肥胖课题,PPAR-2及UCP2基因多态性与成都地区 单纯性肥胖相关性初探,PPAR-2 调节脂肪组织分化，脂质代谢方面发挥关键作用 其基因突变发生于染色体3p25 外显子2的第12位密码子CCA-GCA突变 造成脯氨酸转变为丙氨酸，即PA多态性,UCP2 调节机体的基础代谢率(BMR)来控制体重 其定位于人类11号染色体(11q13) 外显子2 ，第55位密码子GCA-GTA突变 造成丙氨酸转变缬氨酸，即AV多态性,600bp 500bp 400bp 300bp 250bp 200bp 150bp 126bp 100bp 98bp Maker 1 2 3 图9 UCP2 PCR产物经Bbv内切酶酶切后3.5%琼脂糖凝胶电泳结果 注：基因型为AA型:被酶解为98bp,1条带(第3泳道); 基因型为AV型:被酶解为126bp、98bp，2条带(第1泳道) 基因型为VV型:被酶解，仍为126bp l条带(第2泳道),A V,V V,AA,DNA多态性分析常用的方法,限制性片段长度多态性分析 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性DNA分析技术 (RAPD) 细菌基因组重复序列PCR技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。,二、扩增片段长度多态性分析技术 Amplified fragment length polymorphism，AFLP, 结合了限制性酶切消化的可靠性和严格的PCR退火条件，有高度特异性，既克服了RFLP技术中Southen杂交繁琐和耗时的缺点，又解决了RAPD等技术中非特异PCR扩增引起的可信度问题。,AFLP技术的发明,基 本 原 理,AFLP指纹图谱是通过PCR技术扩增基因组DNA限制性酶切片段，然后在高分辨率聚丙烯酰胺凝胶或毛细管凝胶中电泳而获得。 AFLP技术检测的是酶切位点单核苷酸改变或其临近的用于AFLP引物退火的核苷酸改变所致的序列多态性。,补充原理图,AFLP原理和操作流程图,基本程序,例子：EWGLI制定的军团菌AFLP分型标准方法 1. 细菌培养和模板制备 初次分离的军团菌单个菌株在BCYE-琼脂平板上二次传代，3537培养23d，确定为纯培养。挑取次代纯培养菌落用Nucleon BACC2配套DNA提取液，RNase A酶消化后提取基因组DNA。在260nm吸光度测定基因组DNA浓度。,2. 限制性酶切与连接反应 限制性酶切与连接反应体系包括基因组DNA、接头AFLP-LG1（5-CTCGTAGACTGCG TACATGCA-3）、接头AFLP-LG2（5-TGTACGCAGTCTAC-3）、Pst酶、T4连接酶、1酶连接缓冲液，37反应3h。 与接头连接好的标记DNA片段用2.5mol/L醋酸胺、纯乙醇沉淀。室温孵育5min后，4 12000g离心10min，70%乙醇洗一次，沉淀物干燥后加入100l TE缓冲液配成悬液，-20保存。,3. PCR扩增 PCR扩增反应采用处理过的固化Taq酶珠，反应体系包括模板DNA ，选择性引物（AFLP-Pst-G：5-GACTGCGTACATGCAGG-3），dNTP，2.5mmol/L MgCl2。热循环参数为：94 1min，60 1min，72 2.5min，循环33次。,4. 凝胶电泳 1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压3.45V/cm，电泳4h。需在每一个样品电泳带旁加一个分子量标记条带。每块胶的第一个样品孔加入来源于EWGLI标准化分型的Dresden AFLP015型AFLP产物（EUL No.137）。凝胶经EB染色30min，紫外光下照相或数字记录。,5. 数据分析 将未知型在EWGLI建立的军团菌AFLP型数据库中分析，聚类分析以条带的选择为基础，分群分析通过DICE系数和应用平均数的非加权成组配对法（UDGMA）。条带位置容许误差=2%，最优化位置=0.5%。可分析300bp2500bp的DNA扩增片段。,补充原理图,AFLP原理和操作流程图,影 响 因 素,1. 限制性内切酶 （1）一般采用双酶切 （2）由一个高频内切酶和一个低频内切酶组成 （3）一般高（G+C）摩尔分数的基因组选择识别位点富含（G+C）的内切酶组合；低（G+C）摩尔分数的基因组选择识别位点富含AT的内切酶组合 （4）酶切反应对模板质量要求很高 （5）酶切时间1 3h （6）DNA含量一般0.5g左右，DNA含量不应太高,2. 接头 接头是人工合成的一段短核苷酸双链，一般长度是1117个核苷酸，由中心序列和限制酶切特异序列两部分组成。注意接头5端为非磷酸化，以防接头间的连接并保证其只能在3端与限制性片段连接。,Apa(GGGCC/C)接头的结构 5- TCGTAGACTGCGTACA GGCC-3 3- CATCTGACGCATGT-5,中心序列,酶切位点,补充原理图,AFLP原理和操作流程图,3. 引物设计 引物由三部分组成：与接头序列匹配的中心序列，相应的酶切位点和3端的选择性碱基。 如Apa 引物： 5-GACTGCGTACA GGCCC NNN-3 中心序列 Apa切点 选择性碱基 重要特征是所有引物5 端是G碱基, 可有效防止双链的形成引物。 设计主要在选择性碱基数目及组合上。选择性碱基通常为13个，对基因组较复杂的生物体在两个引物的3端至少有3个选择性核苷酸才能获得合适指纹图，而细菌基因组小，一般1个选择性核苷酸即足够了。,补充原理图,AFLP原理和操作流程图,GG,4. 扩增条件 AFLP反应条件与常规PCR主要不同之处是采用温度梯度PCR，即PCR始于高温复性（一般采用65，比常规PCR退火温度高10左右）以期获得最佳选择性，以后退火温度逐步降低（每循环降低0.7），一直降到最适退火温度，然后在这个温度下完成其余PCR循环。 对于复杂基因，一般采用两步法扩增。,应 用,1. 细菌分型 军团菌、大肠杆菌、根瘤土壤杆菌、表皮葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、黄杆菌属、气单胞菌属、梭状杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和弧菌属等。 2. 细菌鉴定 芽孢杆菌属、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌等。 3. 流行病学调查,AFLP AT ESR: TOWARDS AN INTERNATIONAL STANDARD,A. butzleri,C. coli,C. jejuni,DNA多态性分析常用的方法,限制性片段长度多态性分析 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性DNA分析技术 (RAPD) 细菌基因组重复序列PCR技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。,三、随机扩增多态性DNA分析技术 Random Amplified Polymorphism DNA， RAPD, 以PCR技术为背景，以人工合成的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，经电泳分离后产生DNA指纹图谱。,基 本 原 理,模板DNA经9294变性解链后，在较低温度下退火，此时，有许多位点能与随机合成的短引物互补而形成双链结构。如果某两位点间在可扩增范围之内，且分别位于互补的两条单链上，并且与引物的3端相对应，就可以通过PCR得到一个扩增产物。,基 本 原 理,RAPD所用的一系列DNA引物序列各不相同，但对于任意特定引物，它同基因组DNA序列有其特定结合位点，如果基因组在这些区域发生片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应变化，而使PCR产物增加、减少或发生分子量改变，产生多态性图谱。,基本程序,DNA多态性分析常用的方法,限制性片段长度多态性分析 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性DNA分析技术 (RAPD) 细菌基因组重复序列PCR技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。,细菌基因组重复序列PCR技术repetitive-element PCR, rep-PCR 一种基于PCR的DNA标记技术,rep-PCR-原理,rep-PCR技术是利用基因组中广泛分布的短重复序列（repetitive sequences)为引物进行PCR扩增，通过对PCR产物的电泳结果进行比较，来分析菌株间基因组存在的差异。,rep-PCR-短重复序列,目前研究最多、最常用的细菌基因组短重复序列有：,基因外重复回文序列 （Repetitive Intergenic Palindrome, REP),肠细菌基因间共有重复序列 （Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC),rep-PCR-短重复序列,两者的共同特征是它们在细菌基因组中存在着菌株、种、属水平上的分布和拷贝数量的差异，而序列本身在进化过程中又具有较强的保守性。基于这两种短重复序列的PCR就成为rep-PCR的2个重要的技术,REP-PCR ERIC-PCR,两种短重复序列的特点及功能,REP序列,基因外重复回文序列（REP）又称回文单位，其结构特点是回文性质，其转录的mRNA有形成茎-环（stem-loop）结构的潜能。 REP家族序列由38bp构成，含有6个非常保守的位点及5bp构成的位于非常保守的回文臂之间的保守环。,REP家族序列广泛分布在大肠埃希菌和沙门菌基因组内。REP序列可以单独出现或增加为4个串联的重复单位。在E.coli的染色体上，存在500到1000个的REP串联重复单位，在沙门菌上REP串联重复单位约占基因组的1%。,REP序列的功能：,转录终止作用；,稳定mRNA；,在体内