《FCM样品制备》PPT课件.ppt

FCM的样品制备,Introduction,Content: 1 单分散细胞悬液制备技术 2 细胞生物学特征标记技术 3 荧光染色技术,Source: 1 实体组织 2 血液 3 脱落细胞 4 单层培养细胞,Introduction,实体组织单分散细胞的制备,Categorization: 1 新鲜实体组织 2 石蜡包埋组织,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 Definition: 新鲜实体组织是手术或活检后根据 检测目的而采用样品，此样品应及时进 行适当的保存处理，如及时用固定剂或,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 Definition: 低温对组织进行保存，以避免由于室 温过高、放置间过长而造成组织自溶，影 响检测结果,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 Method: 酶消化法 机械法 化学试剂处理法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 protocol 1 将适合于酶消化的组织置于离 心管中 2 将选好的酶溶液1-2ml加入盛有 消化组织的试管中,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 protocol 3 一般消化20-30min(恒温37C 或室温)，消化期间要间断振 荡或吹打 4 终止消化，收集细胞悬液，以 尼龙网(200目)过滤，除去大团 块，以低速离心除去细胞碎片,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 protocol 5 将制备好的单细胞进行流式 细胞术分析或保存,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 principle 1 可以破坏组织间的胶原 2 可以水解组织细胞的紧密 连结装置的蛋白性物质 3 可以水解组织间的粘多糖物质,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 enzyme 1 蛋白酶类 如胃蛋白酶，木 瓜蛋白酶，链蛋白酶和 中性 蛋白酶等)都能够所有组织中 的细胞 2 胰酶 能水解脂键和肽键,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 enzyme 3 胶原酶 能降解几种分子类型 的胶原 4 溶菌酶 能水解糖蛋白和肽的 糖苷键,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 enzyme 5 弹性蛋白酶 能消化连接组织 的糖蛋白和弹性蛋白的纤维， 可用于解离血管、心脏和肝脏 的细胞,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 announcements 1 酶需要溶解于适当的溶液 中，而这种溶液不致于造 成酶效价降低 2 注意组织在消化液中的消 化时间,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 announcements 3 注意酶活性的PH值 如胃 蛋白酶在碱性环境中失去活 性，胰酶在中性溶剂中活性 不佳 4 注意酶的适用浓度,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 酶消化法 announcements 5 随时注意影响酶活性的其他 因素 6 免疫标记实验时，酶处理可 能改变细胞膜的成分，从而 影响细胞亚群的区分,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 Method: 酶消化法 机械法 化学试剂处理法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 review 机械法分裂实体组织包括：用 剪刀剪碎或用锋利的解剖刀剁碎， 用匀浆器匀浆，用细注射针头抽吸 细胞或细胞器悬液以分散细胞,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 review 采用网搓法同样也能获得大量 的细胞，机械法易造成细胞悬液中 细胞碎片和细胞团块，所以机械法 常与其他方法配合使用,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 剪碎法 网搓法 研磨法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 剪碎法 protocol,将组织块放入平皿中，加入少量的盐水用剪刀将组织剪至匀浆，加入100ml NS 2 用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 剪碎法 protocol,3 离心沉淀1000rpm3-5min，再用NS洗三次，每次以短时低速离心沉淀(500-800rpm)去除细胞碎片,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 剪碎法 protocol,4 以300目尼龙网过滤除去细胞团块 5 70%冰乙醇固定，放入0-4冰箱,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 剪碎法 网搓法 研磨法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 网搓法 protocol,将100目，300目尼龙网扎 在小烧杯上,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 网搓法 protocol,2 把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用NS冲洗，直到将组织搓完,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 网搓法 protocol,3 收集细胞悬液，离心沉淀500-800rpm，2min 4 70%乙醇固定，置0-4冰箱备用,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 网搓法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 剪碎法 网搓法 研磨法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 研磨法 protocol,1 将组织剪至小块 放入组织研磨器中，加入1-2ml NS 3 转动研棒，研至匀浆即可,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 研磨法 protocol,4 加入NS 10-20ml，冲洗研器 收集细胞悬液，并经300目尼 龙网过滤，离心沉淀500-800rpm，1-2min，再用NS洗三次，离心沉淀,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 机械法 研磨法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 Method: 酶消化法 机械法 化学试剂处理法,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 化学试剂处理法 principle 化学试剂处理法的主要原理是将 细胞间起粘连作用的钙镁离子置换出 来，从而使细胞分散下来。,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 化学试剂处理法 principle reagent 0.2%EDTA EDTA0.2g溶解后， 加入Hanks液 100ml，封装高压 消毒，置0-4保存,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 化学试剂处理法 principle reagent 胰酶加EDTA 胰酶0.25g +PBS (PH7.0) 200ml， EDTA0.2g+PBS (PH7.0)200ml，用 时过滤,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 化学试剂处理法 protocol,1 将组织切成薄片放入试管 加入EDTA液5ml，室温，0.5h， 弃之 3 加入胰酶+EDTA液5-10ml，再37恒温水浴30min，间断振荡3-5次,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 化学试剂处理法 protocol,4 用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000rpm，5min，再以生理盐水洗2-3次，离心500-800rpm，1-2min 5 70%乙醇固定置冰箱中被检,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 化学试剂处理法 summary,机械法常常造成严重的细胞 损伤，较低的细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果，需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 化学试剂处理法 summary,2 酶学法、化学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的，但是会造成所测化学成分的不良影响，所以根据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样品和更好的FCM结果,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 announcements:,新鲜组织标本应及时进行保 存，以免组织在室温下放置时间过长，造成细胞自溶导致DNA降解, 影响FCM测定结果,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 announcements:,2 根据实验目的的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 announcements:,3 酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响,需注意不同的组织选用适当 的方法，如富于细胞的肿瘤(淋巴瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化癌、髓样癌以及一些软组织肉瘤)不一定要用酶学或化学法，往往用单独的机械法就可以受到大量单分散细胞,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 announcements:,实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织 announcements:,5 在使用酶学方法时要重视酶的悬液，如含有大量结缔组织的肿瘤，如食管癌、乳癌、皮肤癌等，用胶原酶为好，因为胶原酶具有在Ca2、 Mg 2存在或在血清状态下不发生活性降低的特征,实体组织单分散细胞的制备,Categorization: 1 新鲜实体组织 2 石蜡包埋组织,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,Review:,FCM检测石蜡包埋组织，对其细胞的成分及特性进行定量定性分析已成为临床肿瘤学及基础生物学的主要研究对象。利用新鲜组织进行流式细胞分析，若想获得完整的科研资料是很困难的，例如患者的生存率，至少要等几年的时间,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,Review:,石蜡包埋组织细胞的FCM分析，则能在短时间内获得完整的科研资料，石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立扩大了FCM的应用范围，并有大量临床随访结果的资料重新得到研究和利用。,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,石蜡包埋组织在切片机上切取 40-50m 厚的组织片3-5片 2 将切取的组织片放入食管中 3 加入二甲苯5-8ml(室温)，1-2d，视石蜡脱净与否，可更换一次二甲苯，蜡脱净后弃去二甲苯,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,4 水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度的酒精5ml，每步10min，去乙醇，加入蒸馏水3-5ml，10min后弃之,消化：加入2ml 0.5%胃蛋白酶 (pH值1.5-2.0)置37恒温水浴中消化30min，消化期间每隔10min振荡一次 6 消化30min后，立即加入NS终止消化经300目尼龙网过滤，未消化完的组织片可以二次消化,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,7 收集细胞悬液，离心沉淀1500rpm，以NS 漂洗1-2次，离心沉淀1500rpm，再以 NS 漂洗1-2次，离心沉淀500-800rpm，去碎片,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,制备好的单细胞悬液作涂片， AO染色在荧光显微镜下观察，应为完整细胞核,核发出黄绿色荧光,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,9 单细胞样品1106细胞/ml，加入荧光染液溴化乙啶(EB)或碘化丙啶(PI)1ml，置0-4冰箱30min，经500目铜网过滤后上 机检测,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,protocol:,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,announcements:,一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇，如无絮状物浮起，即视为石 蜡已脱净，反之则没有脱净 2 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化掉,实体组织单分散细胞的制备,石蜡包埋组织,announcements:,3 切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间过长，一般以40-50m为宜,Source: 1 实体组织 2 血液 3 脱落细胞 4 单层培养细胞,Introduction,血液单细胞样品的制备,Categorization: 1 淋巴细胞的制备 2 粒细胞的制备 3 单核细胞制备 4 骨髓细胞中白血病细胞的制备 5 网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备 protocol: 1 取肝素抗凝血2.0ml，用NS 2ml将全血稀释至4ml 2 先将3ml人淋巴细胞分离液 放入另一个离心管，然后将 稀释后的血沿试管内壁缓缓 加入到分离液面之上,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备 protocol: 勿用力过大，以免造成血 液与分离液混合，保持清 晰的分层状态 3 离心200rpm，30min，室温 18-20，离心后可见试管内 的血液清楚的分为4层,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备 protocol: 上层为血浆层，中层为分离液层 (淋巴细胞所处的位置在血浆层 与分离液层中间)，底层为红细 胞，红细胞上为粒细胞,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备 protocol:,稀释全血,分离液,离心前,离心后,血浆,淋巴细胞,粒细胞,红细胞,用吸管将上层与中层之间的淋 巴细胞吸出，收集到另一支离心管，用NS稀释至10ml，离心洗涤2次，每次均以1500rpm, 10min，弃上清后即得到纯度较高的淋巴细胞，但可有少量的单核细胞。,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备 protocol:,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备 protocol:,5 70%冰乙醇固定，置4冰箱保存,血液单细胞样品的制备,淋巴细胞的制备 protocol:,血液单细胞样品的制备,Categorization: 1 淋巴细胞的制备 2 粒细胞的制备 3 单核细胞制备 4 骨髓细胞中白血病细胞的制备 5 网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,粒细胞的制备 protocol: 1 用淋巴细胞分离液对细胞进 行分层 2 粒细胞的比重较淋巴细胞稍 大，因此经分离液分离后的 粒细胞，分层于红细胞之上， 分离液的底部,血液单细胞样品的制备,粒细胞的制备 protocol: 3 以吸管慢慢将粒细胞层吸出， 置另一只离心管内，以5ml的 Hanks液洗涤三次，每次离 心沉淀1500rpm，10min,血液单细胞样品的制备,粒细胞的制备 protocol: 4 在吸取粒细胞的同时常附带一 些红细胞，因此需将红细胞去 除，加入1.0ml低渗溶液，30- 40s 5 再以Hanks液洗涤2次，即 可获得纯度大于95%以上的粒 细胞,血液单细胞样品的制备,Categorization: 1 淋巴细胞的制备 2 粒细胞的制备 3 单核细胞制备 4 骨髓细胞中白血病细胞的制备 5 网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol: 1 取肝素1000u/ml抗凝全血 3.0m1,加入3.0ml NS 将血稀 释,均在无菌条件下操作 2 RPMI-1640培养液10.0ml,放入 培养瓶内,将稀释血加入培养 液中,混匀,与培养瓶接触面要大,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol: 3 放入37恒温箱内孵育30-40min, 取出培养瓶 ,将血倾倒掉,用NS培 养瓶轻轻冲洗一次,以去掉残留的 血液,这时培养瓶壁上贴附了大量 的单核细胞,因为单核细胞具有短 时培养期内贴附快的特点,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol: 而其他细胞没有这个特性,所以利 用这一特性进行短时培养可获得 较纯的单核细胞,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol: 4 将粘附于培养瓶壁上的单核细胞 消化下来,用0.25%胰酶消化10 15min,室温下,并不断摇震,以促 使细胞脱落下,单核细胞的粘附 力很强,用酶消化往往获得细胞 数少,目前亦采用机械的方法,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol: 用一橡皮刷,伸入培养瓶在瓶壁上 轻擦,将细胞刮取下,但切勿用力过 大,造成细胞损伤过多 5 脱落下来的细胞移入离心管,离心沉 淀1500rpm,5min,再以NS漂洗23 次,每次离心800rpm,2min,以去除碎 片杂质,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol: 6 将细胞涂片,以盯啶橙染色,置荧 光显微镜下观察形态和纯度 7 将细胞以70%乙醇固定,置0-4 冰箱保存备检,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol:,血液单细胞样品的制备,Categorization: 1 淋巴细胞的制备 2 粒细胞的制备 3 单核细胞制备 4 骨髓细胞中白血病细胞的制备 5 网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol:,1 抽取骨髓0.5ml 2 将0.5ml骨髓标本滴入肝素(1000u/ml)抗凝2.0ml PBS液中 3 再加入PBS液稀释至4ml,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol:,4 将稀释的4ml骨髓液缓慢加入到盛有3.0ml人类淋巴细胞分离液面之上,保持不要混合 5 离心沉淀2000rpm,20min,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol:,6 在以上条件下,将淋巴细胞、单核细胞、髓性细胞,白血病细胞与较大的红细胞,红母细胞在PBS人类淋巴细胞分离液中形成一个界面 7 吸去红细胞和红母细胞,血液单细胞样品的制备,单核细胞的制备 protocol:,8 以PBS液洗留下的界面上的细胞,离心1000rpm,3min 9 弃上清液,即可进行标记染色和流式分析,血液单细胞样品的制备,Categorization: 1 淋巴细胞的制备 2 粒细胞的制备 3 单核细胞制备 4 骨髓细胞中白血病细胞的制备 5 网织红细胞的制备,血液单细胞样品的制备,网织红细胞的制备 protocol:,1 取全血0.5ml，注入盛有0.5ml的 0.1mol/LEDTA溶液中 用微量取溶器吸取50ul EDTA抗 凝血置于另一离心管中，加入Goods 缓冲液5.0ml，离心沉淀 100Orpm，5min,连续洗三次,血液单细胞样品的制备,网织红细胞的制备 protocol:,将沉淀细胞加入1.0ml拘橡酸纳缓冲液，轻轻振荡悬浮 4 将悬浮液缓注入盛有4.0ml 0.1%戊二醛缓冲液中固定，若即上机检测，固定15min即可,血液单细胞样品的制备,网织红细胞的制备 protocol:,如不马上检测，可固定2h后，PBS洗去固定剂，加入1.0ml拘橡酸纳缓冲液，置入4.0 冰箱备检，可保存一周时间,血液单细胞样品的制备,网织红细胞的制备 protocol:,FCM分析前，用PBS洗去固定 剂，加入0.5ml 0.01%派若宁Y工作液，染色30min后，离心 沉淀弃去染液，用PBS离心洗涤一次，1500rpm，5min，去上清液，再用PBS将细胞悬浮上机检测,Source: 1 实体组织 2 血液 3 脱落细胞 4 单层培养细胞,Introduction,脱落细胞单细胞样品的制备,Review: 在临床实际工作中，可收集到大量自然脱落的细胞，这些细胞标本经过简单的处理，就可得到较好的单分散细胞悬液，所以是流式细胞术检测的天然样品,脱落细胞单细胞样品的制备,Categorization: 1宫颈脱落细胞悬液的制备 2食管脱落细胞悬液的制备 3胸腹水脱落细胞的制备 4内镜刷检样品单细胞悬液制备 5 冲洗液样品单细胞悬液制备,脱落细胞单细胞样品的制备,宫颈脱落细胞悬液的制备,Protocol:,1 首先用NS冲洗宫颈表面的分泌 物,以海棉轻拭宫颈表面,将海棉 中吸附的脱落细胞洗脱到20ml NS 中,脱落细胞单细胞样品的制备,宫颈脱落细胞悬液的制备,Protocol:,收集细胞悬液,以1500rpm离心 沉淀,用NS洗涤2次,每次5min,弃上清后加入70%乙醇3ml固定备检,脱落细胞单细胞样品的制备,Categorization: 1宫颈脱落细胞悬液的制备 2食管脱落细胞悬液的制备 3胸腹水脱落细胞的制备 4内镜刷检样品单细胞悬液制备 5 冲洗液样品单细胞悬液制备,脱落细胞单细胞样品的制备,食管脱落细胞悬液的制备,Protocol:,将食管拉网器上的细胞洗脱到 10ml NS 中,以1500rpm离心沉淀,再用NS洗涤2次,离心500-800rpm，1-2min,弃上清,脱落细胞单细胞样品的制备,食管脱落细胞悬液的制备,Protocol:,调整细胞数在2X106/ml,可进行标记染色上机,如不马上检测可用70% 的冰乙醇固定保存 3 在标记染色前如发现细胞有团块聚集，可用0.5%胃蛋白酶(PH1.5-2.0)在37水浴箱中消化5-10min，振荡分散为单细胞悬液,脱落细胞单细胞样品的制备,Categorization: 1宫颈脱落细胞悬液的制备 2食管脱落细胞悬液的制备 3胸腹水脱落细胞的制备 4内镜刷检样品单细胞悬液制备 5 冲洗液样品单细胞悬液制备,脱落细胞单细胞样品的制备,胸腹水脱落细胞悬液的制备,Protocol:,1 抽取胸腹水200-300ml，加入抗凝 剂(肝