GBT28103-2011小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

I C S6 5 0 2 0 0 1 B1 6 圆亘 中华人民共和国国家标准 G B T2 8 1 0 3 2 0 1 1 小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法 D e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fw h e a ts t r e a km o s a i cv i r u s 2 0 1 1 1 2 3 0 发布 2 0 1 2 0 6 0 1 实施 宰瞀徽紫瓣警矬瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“”。 刖置本标准按照G B T1 1 - - 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会( S A C T C2 7 1 ) 提出并归E l 。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭京泽、廖芳、刘跃庭、张裕君、刘勇、崔铁军、王金成。G B T2 8 1 0 3 2 0 ” 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 1 范围小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法本标准规定了小麦线条花叶病毒( w h e a ts t r e a km o s a i cv i r u s ) 检疫鉴定方法。本标准适用于禾本科植物种子和苗木中的小麦线条花叶病毒检疫鉴定。2 规范性引用文件G B T2 8 1 0 3 2 0 1 1下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。S N T1 8 4 0 植物病毒免疫电镜检测方法S N T2 1 2 2 进出境植物及植物产品检疫抽样3 小麦线条花叶病毒基本信息小麦线条花叶病毒w h e a ts t r e a km o s a i cv i r u s ，属于马铃薯Y 病毒科P o t y y i r i d a e ，小麦花叶病毒属T r i t i m o v i r u s 。缩写：W S M V 。小麦线条花叶病毒传播途径有：汁液摩擦传播；种传；介体传播。该病毒容易通过汁液摩擦方式近距离扩散。该病毒能通过带病小麦种子的调运远距离传播。该病毒的传毒介体为小麦卷叶螨A c e r i at o s i c h e l l a ，成虫和若虫均可带毒传染，卵不传病毒。小麦线条花叶病毒其他信息参见附录A 。4 方法原理小麦线条花叶病毒的形态学特征、分子生物学特性和血清学特性是该病毒检疫鉴定方法的主要依据。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法、植物病毒免疫电镜检测方法、反转录聚合酶链式反应检测方法，确定样品中带有的小麦线条花叶病毒。5 仪器设备、用具及试剂5 1 仪器设备酶标仪、洗板机、恒温水浴锅、普通冰箱( o 4 ) 、2 0 低温冰箱、一8 0 超低温冰箱、植物光照培养箱( 温度可调范围为0 5 0 ) 、超净工作台、电子天平( 1 l o0 0 0g ) 、微量榨汁机、透射电子显微镜、低速离心机( 转速为30 0 0r m i n 50 0 0r m i n ) 、P C R 仪、纯水仪、电泳仪、凝胶成像系统。5 2 用具可调微量移液器( 2 5p L 、1 0p L 、1 0 0p L 、10 0 0p L 、50 0 0t t L ) 和相应的吸头、酶联板、封口膜、p H计或p H 试纸条( 广泛试纸和精密试纸) 、1 5m L 离心管、P C R 反应管、容量瓶( 5 0 0m L 、10 0 0m L ) 、解剖刀片、镊子、剪刀、吸水纸、白瓷盘、记号笔、标签、一次性手套。】 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 G B T2 8 1 0 3 2 0 1 15 3 试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定的检测试剂( 见附录B ) 。反转录聚合酶链式反应检测试剂( 见附录c ) 。植物病毒免疫电镜检测试剂( 见S N T1 8 4 0 ) 。6 现场检测按照S N T2 1 2 2 的规定进行检疫并抽取种子和种苗样品。7 实验室检测对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定( D A S - E L I S A ) ，检验程序见附录B 。对样品进行反转录聚合酶链式反应( R T - P C R ) 测定，检验程序见附录C 。对样品进行植物病毒免疫电镜( I E M ) 测定，检验程序见S N T1 8 4 0 。在电镜下观察到弯曲线状病毒粒子，测定其大小为1 5n m X7 0 0n m ，病毒粒子周围有抗体晕圈，则I E M 测定结果为阳性。否则I E M测定结果为阴性。8 结果判定样品经过D A S E L I S A 、R T - P C R 测定或I E M 测定，其两种或两种以上测定结果均为阳性，则判定该样品带有小麦线条花叶病毒。否则判定样品不带有小麦线条花叶病毒。9 样品保存与结果记录9 1 样品保存在适宜环境中保存已鉴定带有小麦线条花叶病毒的样品。如叶片应在超低温冰箱中单独保存或冻干保存；生长的苗木应在植物光照培养箱中单独培育；种子应在干燥条件下保存。9 2 结果记录与资料保存记录各项数据，包括样品的种类、来源和样品状况，检测的时问、地点、方法和结果，测定人员的签字。D A S E L I S A 的测定结果应保存吸光值数据报告，R T - P C R 测定结果应保存电泳照片，I E M 测定结果应保存病毒粒体照片。2 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 A 1 形态学特征附录A( 资料性附录)小麦线条花叶病毒其他信息病毒粒子形态为弯曲线状，无包膜，长6 9 0n m 7 0 0n m ，直径1 1n m 1 5n m 。A 2 地理分布G B T2 8 1 0 3 2 0 1 1最初报道于美国，目前在美洲、北非、中东、中亚、东亚、东南亚以及欧洲、澳大利亚均有发生。在我国西北的甘肃、陕西等地区曾有发生。A 3 寄主范围及症状小麦线条花叶病毒侵染许多小麦品种以及燕麦、大麦、黑麦、一些玉米品种和黍，还侵染多种单子叶杂草，但不侵染双子叶植物。小麦线条花叶病毒引起小麦严重花叶和矮化症状。在小麦苗期，植株叶色变淡，叶片变窄，叶上出现细小褪绿条点及黄色小点，与叶脉平行，并逐渐发展成苍白色断续条纹，部分组织坏死。苍白条纹不规则愈合，在苍白背景的叶片上有残余绿色条纹，叶片是一侧向内纵向卷曲。新叶片上也有褪色条纹，叶脉浊化稍暗。小麦拔节后，节间向下成弧状弯拐，节外复又向上各节的向地一侧异常膨大造成全茎呈拐节状，此症状在基部1 节3 节最为明显。病情严重的植株，全株分蘖向四周匍匐，穗鞘扭卷，不易抽穗或穗而不实。整个病田表现植株松散，外型异常。小麦线条花叶病毒对小麦产量影响大，轻者减产3 0 5 0 ，重者颗粒无收。诊断寄主：小麦、大麦、燕麦的所有品种和部分玉米品种表现系统花叶症状并且矮化。该病毒的某些分离物侵染高粱( S o r g h u mb i c o l o r ) 偶然出现坏死斑症状。繁殖寄主：冬小麦任何品种都适于做该病毒的繁殖寄主。测定寄主：没有合适的局部斑测定寄主。A 4 分子生物学特性小麦线条花叶病毒的核酸为单分子正义s s R N A ，长为8 5k b ，相对分子量为2 8 X 1 0 6 ，核酸占病毒粒子质量约为5 。小麦线条花叶病毒的基因组为单分体基因组，R N A 的5 端为V P g ，3 端为P o | y ( A ) 。基因组编码一个3 4 4 k D a 的多聚蛋白，然后切割成1 0 个产物，分别为4 0 k D a 的P 1 蛋白、4 4 k D a 的H C - P r o 蛋白、3 2 k D a 的P 3 蛋白、6 k D a 的6 K 1 蛋白、7 3 k D a 的柱状内含体解旋酶、6 k D a 的6 K 2 蛋白、2 3 k D a 的V P g 、2 6 k D a 的N I a 蛋白、6 4 k D a 的N I b 蛋白及3 0 k D a 的外壳蛋白。 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 G B T2 8 1 0 3 2 0 11B 1 试剂附录B( 规范性附录)双抗体夹心酶联免疫吸附测定( D A S E L I s A ) 方法检测B 1 1 包被缓冲液( p H 9 6 )碳酸钠( N a z C O 。) 1 5 9g ，碳酸氢钠( N a H C O s ) 2 9 3g ，叠氮化钠( N a N 。) 0 2 0g ，溶解于9 0 0m L 蒸馏水中，用盐酸调节p H 至9 6 ，用蒸馏水定容至10 0 0m L 。B 1 2P B S T 缓冲液( p H 7 4 )氯化钠( N a C l ) 8 0g ，磷酸二氢钠( K H z P O t ) 0 2g ，磷酸氢二钠( N a ：H P O 。) 1 1 5g ，氯化钾( K C l )0 2g ，0 5m LT w e e n - 2 0 ，叠氮钠( N a N a ) 0 2g ，溶解于9 0 0m L 蒸馏水中，用盐酸调节p H 至7 4 ，蒸馏水定容至10 0 0m L 。B 1 3 样品抽提缓冲液亚硫酸钠( N a z S 0 3 ) 2 0g ，2 0gP V P ( M W2 4 40 0 0 ) ，加P B S T 缓冲液10 0 0m L 。B 1 4 酶标抗体缓冲液2 0gP V P ( M W2 4 40 0 0 ) ，B S A2 0g ，加P B S T 缓冲液10 0 0m L 。B 1 5 底物缓冲液二乙醇胺9 7m L ，蒸馏水6 0 0m L ，用盐酸调p H 至9 8 ，然后用蒸馏水定容至10 0 0m L 。B 1 6 底物p N P P ( 对一硝基苯磷酸钠)B 1 7 种子表面消毒液将3 0 次氯酸钠( N a C I O ) 1 0 0m L 溶于9 0 0m L 蒸馏水中，制成3 种子表面消毒液。B 1 8 生物制剂小麦线条花叶病毒检测试剂盒( W S M V 特异性抗体和酶标记抗体) 。小麦线条花叶病毒阳性质控。小麦线条花叶病毒阴性质控。B 2D A S - E L I S A 检测B 2 1 样品制备B 2 1 1 种子类随机抽取或针对性挑选1 0 0 粒种子，浸入种子表面消毒液中消毒1 0r n i n ，用灭菌蒸馏水洗涤种子三次。将种子摆放于铺有湿润吸水纸的白瓷盘内。在植物光照培养箱中，使种子在适宜的发芽温度( 2 0 2 8 ) 下催芽长出叶片。4 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 G B T2 8 1 0 3 2 0 11用微量榨汁机研磨叶片并加入抽提缓冲液，样品质量与抽提缓冲液体积之比为1 ：1 0 。研磨的植物汁液盛于离心管中，低速离心2m i n ，上清液为待检样品液。B 2 1 2 种苗类随机抽取至少2 0 株种苗的叶片0 2g ，或针对性采集表现症状的病叶。用微量榨汁机研磨叶片并加入抽提缓冲液，样品质量与抽提缓冲液体积之比为1 ：1 0 。研磨的植物汁液盛于离心管中，低速离心2r a i n ，上清液为待检样品液。B 2 2 检测步骤B 2 2 1 在酶联板上设定待检样品孔和对照孔孔位。对照孔包括2 个阳性质控孔、2 个阴性质控孔、2 个空白对照孔。每个待检样品设定两个孔位。B 2 2 2 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释W S M V 包被抗体，每孔加入1 0 0p L 抗体溶液。用封口膜包好酶联板，水浴锅中3 7 孵育2h 或4 冰箱过夜。B 2 2 3 洗板机洗板3 次，洗涤液为P B S T 缓冲液。B 2 2 4 每个待检样品孔加入1 0 0p L 待检样品液。相应的对照孔中加入1 0 0p L 阳性质控，1 0 0p L阴性质控和1 0 0p L 样品抽提缓冲液。用封口膜包好酶联板，水浴锅中3 7 孵育4h 或4 冰箱过夜。B 2 2 5 洗板机洗板4 次6 次，洗涤液为P B S T 缓冲液。B 2 2 6 按要求的浓度和需要的体积用酶标抗体缓冲液稀释W S M V 酶标抗体，每孔加入1 0 0p L 酶标抗体溶液，用封口膜包好酶联板，水浴锅中3 7 孵育2h 4h 。B 2 2 7 同步骤B 2 2 3 洗板。B 2 2 8 按lm g m L 的浓度将o N P P ( 对一硝基苯磷酸钠) 溶于底物缓冲液中( 现用现配) 。每孔加入1 0 0 “L 底物溶液。室温下避光环境中放置3 0m i n 6 0m i n 。B 2 2 9 用酶联仪在4 0 5n m 波长下测定各孔的吸光值( O D 。) 。B 3 质量控制要求和结果判定B 3 1 质量控制要求满足以下条件时，检测结果有效：空白对照和阴性质控的O D 4 。值小于0 1 5 ；阳性质控O D 。阴性质控O D 4 。在3 1 0 之间；一重复检测样品O D 值平行允许率( P ) 小于2 0 。如阴性质控的O D + 。；值小于0 0 5 时，按0 0 5 计算。平均允许率按式( B 1 ) 计算：P 一盅高X1 0 0 ( B 1 B O DO D z)(1 +2 )、7式中：P 平行允许率；O D 。重复样品1 ；O D 。重复样品2 。B3 2 结果判定在满足B 3 1 的质量要求后，按如下原则作出判定：样品O D 4 0 5 阴性质控O D 。值大于2 ，D A S - E L I S A 结果判定为阳性；样品O D 。阴性质控O D 。；值等于2 ，判定为可疑，需重做一次或者用其他方法进行验证样品O D 一阴性质控O D t o s 值小于2 ，D A S - E L I S A 结果判定为阴性。 标准分享网 w w w .b z f x w .c o m 免费下载 G B T2 8 1 0 3 2 0 11C 1 试剂附录c( 规范性附录)反转录聚合酶链式反应( R T - P C R ) 方法检测C 1 1 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、M g C I z 、3m o l L 醋酸钠( p H 5 2 ) 、无水乙醇、D E P C 、溴化乙锭、琼脂糖、d N T P s 、T a q 酶、M M L V 反转录酶、R N a s ei n h i b i t o r 、M M L V 反转录缓冲液、T r i z o l R N A 抽提缓冲液、l o P C R 缓冲液、T A E 电泳缓冲液、T E 缓冲液、溴酚蓝载样缓冲液。c 1 2R N A 抽提试剂盒、R T - P C R 试剂盒。C 1 3 小麦线条花叶病毒阳性对照、阴性对照、D N Al a d d e rm a r k e r 。C 2 实验步骤C 2 1R N A 提取将2 5 0m g 植物材料置于离心管中，液氮冷冻，研碎。悬浮于7 5 0p L 抽提缓冲液中，继续研磨。再加入等体积的饱和酚：三氯甲烷：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，混匀。1 30 0 0r r a i n 离心5m i n ，取上清液。加入1 1 0 体积的3m o l L 醋酸钠( p H 5 2 ) ，2 5 倍体积的无水乙醇，一8 0 3 0m i n 以上( 或一2 0 过夜) 。1 30 0 0r m i n 离心1 5m i n ，留沉淀。加入3 0 0 “L 的7 5 乙醇洗涤。1 30 0 0r m i n 离心2r a i n ，弃上清液，重复离心一次，风干。将R N A 溶于5 0p L 经D E P C 处理的蒸馏水中，作为待检测核酸。分别从W S M V 阳性对照、阴性对照中提取R N A 。可使用R N A 提取试剂盒并按照说明书进行操作。C 2 2 引物合成依据文献( D e bM A n d e r s o nJM ，2 0 0 8 ) 所设计的引物序列W S M VL 2 ：5 一C G AC A AT C AG C AA G AG A CC A 一3 W S M VR 2 ：5 一T G AG G AT C GC T GT G TT T CA G 一3 扩增产物大小约为1 9 0b p 。C 2 3R T - P C R 检测C 2 3 1e D N A 的合成反应体系为2 0 弘L ，包括2 0t u m o l L 引物1p L ，R N a s e f r e eH 。O8 5p L ，待检测核酸2 弘L ，空白对照用R N a s ef r e eH 2 0 。8 8 水浴1 0m i n 后，置于冰上，加入1 0m m o l L 的d N T P1p L ，4 0U t 1 L 的R N a s ei n h i b i t o r0 5p L ，5 倍M M L V