金针菇水溶性多糖物理提取工艺及优化.pdf

2010, Vol. 31, No. 24食品科学工艺技术230 金针菇水溶性多糖物理提取工艺及优化 孔晓雪，安辛欣 *，赵立艳，胡秋辉 (南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095) 摘 要：对比研究湿法超微粉碎提取、微波辅助提取、超声波辅助提取等不同提取方法，对金针菇可溶性多糖 提取效果的影响，采用响应曲面试验设计法优化湿法超微粉碎提取金针菇水溶性多糖的工艺条件。结果表明，湿 法超微粉碎提取法能显著提高金针菇水溶性多糖的提取率，优化后的工艺参数为胶体磨磨齿间隙42m、提取温度 87、提取时间170min。根据模型预测提取液中多糖含量为417.6g/mL，验证实验中多糖含量为(4183.21)g/mL， 提取率为 3.63%。 关键词：金针菇；水溶性多糖；湿法超微粉碎；响应曲面 Optimization of Extraction Processing for Water-soluble Polysaccharides from Flammulina velutipes KONG Xiao-xue，AN Xin-xin*，ZHAO Li-yan，HU Qiu-hui (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China) Abstract ： Wet ultra-fine pulverization extraction, microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction were used to explore the optimal extraction conditions of water-soluble polysaccharides from Flammulina velutipes. Response surface methodology (RSM) was employed to optimize the conditions of wet ultra-fine pulverization extraction for water-soluble polysaccharides. Results indicated that the optimal extraction processing parameters were the gap of colloid mill at 42m, extraction temperature of 87 and extraction time of 170 min. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of polysaccharides was 3.63%. The concentration of water-soluble polysaccharides based on predictive model was 417.6g/mL, and the actually determined concentration of water-soluble polysaccharides was (418 3.21 )g/mL. Key words：Flammulina velutipes；water-soluble polysaccharides；wet ultra-fine pulverization extraction；response surface methodology (RSM) 中图分类号：TS201 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)24-0230-06 收稿日期：2010-11-02 基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项 作者简介：孔晓雪(1985 )，女，硕士研究生，研究方向为食品营养化学。E-mail： * 通信作者：安辛欣(1960 )，男，副教授，硕士，研究方向为食品营养化学。E-mail： 金针菇(Flammunlina velutipes)为担子菌目金钱菌 属，是一种药食两用菌，其子实体含蛋白 31.2%，含 有丰富的维生素(VB1、VB2、VC、Vpp)和多种氨基 酸1-2。金针菇多糖是金针菇中主要的生物活性成分之 一，具有抑制肿瘤、抗癌、增强机体免疫力等作用3-5。 金针菇多糖的提取方法大致分为 3 类：水提醇沉 法、酶解法、物理提取法。水提醇沉法操作简便但提 取率不高，已报道的提取率(以金针菇干质量计)在 1.6% 左右6-7。酶解法中使用较多的是纤维素酶，该法提取 率在 2% 左右8。物理提取法主要是指通过微波、超声 波、超微粉碎等物理手段辅助提取多糖，该法能有效 提高金针菇多糖提取率，研究发现微波可使多糖提取率 提高 83.67%9-11，超声波可使多糖提取率提高 76.22%9。 本实验研究微波、超声波、湿法超微粉碎(胶体磨 处理)辅助提取对金针菇多糖的工艺，并通过响应曲面 试验设计对湿法超微粉碎提取金针菇多糖的工艺条件进 行优化，以期能够提高金针菇多糖提取率，从而为金 针菇多糖的研究提供参考。 1材料与方法材料与方法 1.1材料、试剂与仪器 金针菇白色品系 F21，购于高淳金针菇种植基地， 无开伞，平均含水量为 85%。 葡萄糖标准溶液(100g/mL)、Sevag试剂(体积比5:1的 氯仿正丁醇混合溶液)、硫酸、蒽酮、无水乙醇等均为 分 析 纯 。 231工艺技术食品科学 2010, Vol. 31, No. 24 编号提取方式操作 1热水提取加入护色剂，料液比 1:15(g/mL)组织破碎 30s，85热水提取 90min，测提取液中多糖含量 2湿法超微粉碎 加入护色剂，料液比 1:15 组织破碎 30s，胶体磨胶磨 (转子转速 8000r/min， 磨齿间隙 40m)，85热水提取 90min，测提取液中多糖含量 3超声波 加入护色剂，料液比 1:15 组织破碎 30s，超声波处理 15min(80Hz，25)， 85热水提取 90min，测提取液中多糖含量 4微波 加入护色剂，料液比 1:15 组织破碎 30s，微波处理 4min(500W)， 85热水提取 90min，测提取液中多糖含量 5湿法超微粉碎超声波 加入护色剂，料液比 1:15 组织破碎 30s，胶体磨处理，超声 波处理 15min(80Hz，25)，85热水提取 90min，测提取液中多糖含量 6湿法超微粉碎微波 加入护色剂，料液比 1:15 组织破碎 30s，胶体磨处理， 微波处理 4min(500W)，85热水提取 90min，测提取液中多糖含量 表表 1 对照实验操作步骤 对照实验操作步骤 Table 1 Operation procedures of different extraction metods 注：护色剂为质量比 1:3 的柠檬酸与 EDTA-2Na 混合物，加入量为 0.2g/100g 鲜菇。 编码A 磨齿间隙 /mB 温度 /C 提取时间 /min 13080120 04090150 150100180 表表 2 Box-Behnken 响应曲面设计试验因素水平和编码响应曲面设计试验因素水平和编码 Table 2 Factors, levels and codes of Box-Behnken response surface experiments UV-2450 紫外分光光度计 日本岛津公司；SANLE- WZD1S 型微波设备 南京三乐微波设备有限公司；AS 20500A 超声仪 瑞士 Buchi 公司；L50 试验室专用胶体 磨 上海诺尼机械厂；HH-42 数显恒温水浴锅 常州国 华电器有限公司；电热鼓风干燥箱 上海第三仪器厂； AUY120 电子分析天平 日本岛津公司；植物组织破碎 机 台湾联中电器厂；Avanti J-E 落地式高效冷冻离心 机 美国 Beckman Coulter 公司。 1.2方法 1.2.1金针菇多糖提取方法筛选 准确称取 18 份金针菇，每份 100.00g，分为 6 组依 次编号为 1 、2 、3 、4 、5 、6 ，操作步骤如表 1 所 示。通过对比实验选择适宜的提取方法，并对该方法 进行单因素与响应曲面试验优化。 1.2.2湿法超微粉碎提取金针菇多糖工艺的单因素优化 以提取液中多糖含量为指标，对金针菇多糖的湿法 超微粉碎提取工艺的 5 个单因素(提取次数、料液比、胶 体磨磨齿间隙、提取温度和提取时间)进行优化。 提取次数的影响：准确称取数份 100.00g 新鲜金针 菇，按 1 次提取料液比 1:15，2 次提取料液比 1:10，3 次提取料液比 1:5 进行湿法超微粉碎提取(其余提取条件 与表 1 中 2 组相同)，提取液浓缩为 1500mL 后测定多糖 含 量 。 料液比的影响：按料液比 1:5、1:10、1:15、1:20、 1:25，进行湿法超微粉碎，提取液浓缩或稀释为 1500mL 后测定提取液中多糖含量。 胶体磨磨齿间隙的影响12：调节胶体磨磨齿间隙依 次为 20、40、60、80、100m，将金针菇浆液在胶 体磨中胶磨，得到金针菇超微粉碎浆按表 1 中 2 组的步 骤提取，并测定提取液中多糖含量。 提取时间的影响：金针菇超微粉碎浆，在 80提 取 30、60、90、120、180min(其余提取条件与表 1 中 2 组相同)，测提取液中多糖含量。 提取温度的影响：金针菇超微粉碎浆，在 20、40、 60、80、100范围内提取 90min(其余提取条件与表 1 中 2 组相同)，测提取液中多糖含量。 1.2.3提取液中多糖含量的测定 采用硫酸 - 蒽酮法13进行测定。 1.2.4多糖提取率的计算 多糖总质量/g 金针菇多糖提取率 /%= 100 金针菇干质量/g 1.2.5Box-Behnken 响应曲面设计 根据湿法超微粉碎提取工艺的单因素试验结果， 选择磨齿间隙、提取温度、提取时间 3 个因素为研究对 象，以提取液中多糖含量为响应值设计 Box-Behnken 试 验，对湿法超微粉碎提取工艺进行进一步优化。试验 因素水平及编码见表 2。 1.2.6回归模型验证实验 按照 Design Expert 7.0 给出的最优参数进行实验， 重复 3 次，计算实验值与理论值之间的误差。 1.3统计分析 数据统计采用 SAS 8.12 进行 ANOVA 单因素方差分 析及 Ducan s 多重检验(P 0.05)，数据以平均值标准 差表示。响应曲面优化及数据分析采用 Design Expert 7.0 软件。 , 2010, Vol. 31, No. 24食品科学工艺技术232 注：提高率指 2、3、4、5、6 组与 1 组相比的提高率；ac.同列不 同字母表示差异显著。 提取方式提取液中多糖含量/( g/mL)提高率/% 热水提取(1)303 13.43c 湿法超微粉碎提取(2)396 15.56a75 超声波辅助提取3)359 11.31b22 微波辅助提取(4)343 8.48b14 湿法超微粉碎超声波辅助提取(5)411 10.61a83 湿法超微粉碎微波辅助提取(6)402 8.92a68 表表 3 不同提取方式提取效果比较 不同提取方式提取效果比较 Table 3 Comparison of extraction rates using different extraction methods 图图 1 提取次数对多糖含量的影响 提取次数对多糖含量的影响 Fig.1 Effect of extraction repeat number on the content of polysaccharides 400 350 300 250 200 多糖含量/(g/mL) 提取次数 123 图图 2 料液比对多糖含量的影响 料液比对多糖含量的影响 Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the content of polysaccharides 500 400 300 200 100 0 多糖含量/(g/mL) 料液比(g/mL) 1:51:101:151:201:25 图图 3 胶体磨磨齿间隙对多糖含量的影响 胶体磨磨齿间隙对多糖含量的影响 Fig.3 Effect of colloid mill gap on the content of polysaccharides 500 400 300 200 100 0 多糖含量/(g/mL) 胶体磨磨齿间隙 /m 20406080100 2结果与分析结果与分析 2.1葡糖糖标准曲线的绘制 葡萄糖标准曲线回归方程如下： y=0.0059x 0.0046，R2=0.9998 式中：y 为吸光度；x 为葡萄糖标准曲线中对应的 葡萄糖质量浓度 /( g/mL)。 2.2金针菇多糖提取 如表 3 所示，超声波、微波辅助提取能显著提高 提取液中多糖含量(P 0.05)；湿法超微粉碎提取、湿 法超微粉碎与超声波结合辅助提取、湿法超微粉碎与微 波结合辅助提取，能极显著的提高提取液中多糖含量(P 0.01)，其中湿法超微粉碎与超声波结合辅助提取法， 提取液中多糖含量最高，较热水提取工艺提高 83%，但 与湿法超微粉碎处理组相比提取液中多糖含量没有显著 差异，为了简化工艺，本实验中金针菇水溶性多糖的 提取采用湿法超微粉碎提取法。 2.3湿法超微粉碎提取法单因素试验 2.3.1提取次数对多糖含量的影响 如图 2 所示，随料液比比值减小多糖提取率逐渐升 高，当料液比比值小于 1:15 时，提取液中多糖含量上 升趋势减缓，结果表明金针菇多糖湿法超微粉碎提取适 宜的料液比为 1:15。 2.3.3胶体磨磨齿间隙对多糖含量的影响 如图 3 所示，随胶体磨磨齿间隙的增加，多糖提 取率呈先增大后减小的趋势，当磨齿间隙为 40m 时， 提取液中多糖含量最高，达 384g/mL。磨齿间隙越小， 金针菇粉碎的粒径越小，细胞壁破壁率越高，多糖越 容易溶出，可以很快溶解到提取溶剂中；但如果粒子粒 径继续减小，颗粒表面能会增加，将对一部分多糖产 生吸附作用，反而使溶剂中多糖含量下降12,14，适宜的 磨齿间隙选为 40m。 2.3.4提取时间对多糖含量的影响 如图 1 所示，随提取次数增加，多糖提取率逐渐 增加，其中 1 次提取与 2 次提取相比，多糖提取率增加 显著；两次提取与 3 次提取相比，多糖提取率增加不显 著，从工艺耗时和经济方面考虑，提取次数选择 2 次。 2.3.2料液比对多糖含量的影响 图图 4 提取时间对多糖含量的影响 提取时间对多糖含量的影响 Fig.4 Effect of extraction time on the content of polysaccharides 400 300 200 100 0 多糖含量/(g/mL) 提取时间 /min 306090120150180 233工艺技术食品科学 2010, Vol. 31, No. 24 90.0 87.5 85.0 82.5 80.0 多糖含量/(g/mL) 提取温度 / 磨齿间隙 /m 3035404550 370.97 370.97 354.021 337.073 404.866 389.918 5 图图 5 提取温度对多糖含量的影响 提取温度对多糖含量的影响 Fig.5 Effect of extraction temperature on the content of polysaccharides 400 300 200 100 多糖含量/(g/mL) 温度 / 2030405060708090100 表表 4 响应曲面试验设计及结果 响应曲面试验设计及结果 Table 4 Design and results of response surface experiments 试验号ABC多糖含量/( g/mL) 11 10317 2.1 2 1 10368 0.7 3110374 1.6 4 110361 5.4 510 1325 1.8 6 10 1348 2.4 7101390 1.6 8 101388 1.3 90 1 1330 3.4 1001 1376 1.5 110 11406 4.2 12011402 3.5 13000418 6.2 14000420 3.7 15000419 4.3 16000424 5.1 17000421 2.9 方差来源平方和自由度均方F值P值 模型17394.8991932.77198.81 0.0001 A435.131435.1344.760.0003 B1058.0011058.00108.83 0.0001 C5356.1315356.13550.96 0.0001 AB1024.0011024.00105.33 0.0001 AC156.251156.2516.070.0051 BC625.001625.0064.29 0.0001 A25540.5315540.53569.93 0.0001 B21773.7911773.79182.46 0.0001 C2687.161687.1670.69 0.0001 残差68.0579.72 失拟45.25315.082.650.1853 纯误差22.8045.70 总和17462.9416 R20.9961 R2Adj0.9911 表表 5 回归模型的方差分析 回归模型的方差分析 Table 5 Variance analysis of regression equation 如图 4 所示，随着提取时间的延长，提取液中多 糖含量迅速增加，当提取时间超过 150min 后，提取液 中多糖含量有所下降，这可能是因为长时间的高温处理 使提取液中的一部分多糖分子发生了降解13,15，适宜的 提取时间为 150min。 2.3.5提取温度对多糖含量的影响 如图 5 所示，随着提取温度的升高，提取液中多 糖含量迅速增加，当温度超过 80以后，多糖含量上 升趋势减缓。这主要是由于随温度的升高分子活动加 剧，可溶物溶出速率提高，但温度超过 80后，继续 升高温度也不能使提取液中多糖含量继续上升，适宜的 提取温度为 80。 2.4Box-Behnken 响应曲面设计 2.4.1拟合模型的建立 对数据进行回归分析，获得二元多次回归方程： Y=411.80 7.38A 11.50B 25.88C16.00AB 6.25AC12.50BC36.28A2 20.53B212.77C2 2.4.2拟合方程方差分析 响应曲面试验结果见表 4，对模型的方差分析结果 见表 5。分析结果表明，对金针菇多糖得率所建立的二 次多项式模型具有高度显著性(P 0.0001)，方程负相关 系数的平方(R2)为 0.9961，失拟项不显著(P=0.1853)， R2Adj=0.9911，说明建立的模型能够解释 99.11% 响应值的 变化，能很好的描述金针菇多糖湿法超微粉碎提取过程 中多糖提取率随提取条件的变化规律，可以用此模型对 多糖的提取率进行分析和预测16-17。 模型方程回归系数及其显著性检验结果表明，模型 一次项 A、B、C，二次项 A 2、B2、C2，交互项 AB、 AC、BC 对响应值的影响都极显著。 2.4.3交互作用分析 由二次多项式方程所作的响应面图及等高线图见图 57，各因素及其交互作用对响应值的影响可以通过该 组图直观反映出来。等高线的形状反映了交互作用的强 弱，等高线图越接近圆形表明交互作用越不显著18。 磨齿间隙与提取温度的交互作用 2010, Vol. 31, No. 24食品科学工艺技术234 图图 6 胶体磨磨齿间隙与提取时间的等高线图和响应曲面图 胶体磨磨齿间隙与提取时间的等高线图和响应曲面图 Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of cross- interaction between the gap of colloid mill and extraction time on the extraction rate of polysaccharides 图图 7 提取时间与提取温度的等高线图和响应曲面图 提取时间与提取温度的等高线图和响应曲面图 Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of cross- interaction between extraction time and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides 180.0 172.5 165.0 157.5 150.0 多糖含量/(g/mL) 提取时间 /min 磨齿间隙 /m 3035404550 407.958 374.075 357.133 391.017 374.075 340.192 357.133 5 430.0 402.5 375.0 347.5 320.0 多糖含量/(g/mL) 提取时间 /min 172.5 180.0 165.0 157.5 150.030 35 40 45 50 磨齿间隙/m 180.0 172.5 165.0 157.5 150.0 多糖含量/(g/mL) 提取时间 /min 提取温度 / 80.082.585.087.590.0 370.97 408.854 392.808 376.762 360.717 344.671 5 425.00 400.75 376.50 352.25 328.00 多糖含量/(g/mL) 提取时间 /min 172.5 180.0 165.0 157.5 150.0 80.0 82.5 85.0 87.5 90.0 提取温度 / 图 5 显示提取时间最佳值为 171.2min 时，磨齿间隙 与提取温度对多糖提取率的影响。由方差分析表中的 P 值分析得出磨齿间隙与提取温度之间的交互作用极显 著，当把提取温度固定在 85，随磨齿间隙的增加， 在试验范围内提取液中多糖含量先增加后减少，在40m 附近达到峰值。当把磨齿间隙固定在 40m，随提取温 度的升高在试验范围内提取液中多糖含量先增加后减 小，在 8 5 附近达到峰值。 磨齿间隙与提取时间的交互作用 液中多糖含量呈先增加后减少的趋势，在 40m 附近达 到峰值。当把磨齿间隙固定在 40m，随提取时间延长， 提取液中多糖含量持续增加，在165180min内达到峰值。 提取时间与提取温度的交互作用 图 7 显示了磨齿间隙最佳值为 42.2m 时，提取时 间与提取温度对多糖提取率的影响。由方差分析表中的 P 值分析得出提取时间与提取温度之间的交互作用达到 极显著水平。当把提取温度固定在 85，随提取时间 的延长提取液中多糖含量在试验范围内持续增加，在 165180min 内达到峰值。当把提取时间固定在 165min 上，随提取温度升高，多糖含量先增加后减少，在 85 附近达到峰值。 2.4.4模型的优化和验证 通过 Design Expert 7.0 分析得到最佳提取条件为磨 齿间隙 42.2m、提取温度 86.9、提取时间 171.2min。 根据实际情况把工艺参数修正为磨齿间隙 42m、提取 温度 87、提取时间 170min。按照此工艺得到的提取 液中多糖含量为(418 3.21) g/mL，经拟合模型得到的 预测值为 417.6g/mL，与实测值差异不显著，说明该 模型可以很好的预测金针菇水溶性多糖的提取条件与 提取液中多糖含量之间的关系，同时也说明了工艺参 数的可行性。此时的多糖提取率(按金针菇干质量计) 为 3.63%。 图图 5 胶体磨磨齿间隙与提取温度的等高线图和响应曲面图 胶体磨磨齿间隙与提取温度的等高线图和响应曲面图 Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of cross- interaction between the gap of colloid mill and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides 430 400 370 340 310 多糖含量/(g/mL) 提取温度/ 90.0 87.5 85.0 82.5 80.030 35 40 45 50 磨齿间隙/m 图 6 显示提取温度最佳值为 86.9时，磨齿间隙 与提取时间对多糖提取率的影响。由方差分析表中的 P 值分析得出磨齿间隙与提取时间的交互作用极显著。 当把提取时间固定在 165min，随磨齿间隙的增大提取 235工艺技术食品科学 2010, Vol. 31, No. 24 3结 论结 论 湿法超微粉碎(胶体磨处理)、超声波、微波等物理 手段能提高提取液中多糖的含量。其中湿法超微粉碎处 理效果最为明显，与单纯沸水提取相比，湿法超微粉 碎提取法获得的多糖含量提高了 75%。 响应曲面法优化后的多糖提取率为 3.63%，高于已 报道的水提醇沉法和酶解法的提取率，操作简便，工 艺参数切实可行。 参 考 文 献 ：参 考 文 献 ： 1蔡和晖, 廖森泰, 叶运寿, 等. 金针菇的化学成分、生物活性及加 工研究进展J. 食品研究与开发, 2008(11): 171-174. 2KALAC P. 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