响应面法优化木瓜果实中齐墩果酸提取工艺.pdf

分离技术 食品研究与开发 F o o d Re s e a r c h An d De v e l o p me n t 2 0 1 2年 1 月 第3 3 卷第1 期 3 =I 响应面法优化木瓜果实中齐墩果酸提取工艺 孟祥敏。 殷金莲 ( 大兴安岭职业学院， 黑龙江 加格达奇 1 6 5 0 0 0 ) 摘要 ： 为优化提取工艺， 用超声波法提取木瓜果实中的齐墩果酸， 并通过响应面法( R s M) 对提取参数进行优化。 经 高效液相色谱( HP L C) 定量分析， 齐墩果酸的最佳超声提取条件为溶剂无水乙醇、 料液 g l ： 1 6 、 提取温度5 3 、 提取时 1 1 4 5 m i n ， 在该条件下测得木瓜中齐墩果酸含量可达到O 1 4。 试验提取操作简便、 快速， 检测方法灵敏、 重现性好。 关键词： 木瓜； 齐墩果酸； 响应面法； 超声提取 ； 高效液相 色谱法 Op t i mi z a t i o n f o r E x t r a c t i n g T e c h n o l o g y o f Ol e a n o H c A c i d f r o m Qu i n c e F r uit s b y R e s p o n s e S u r f a c e M e t ho d o l o g y ME NG Xi a n g - mi n ， YI N J i n l i a n ( D a x i n g a n l i n g V o c a t i o n a l C o l l e g e ， J i a g e d a q i 1 6 5 0 0 0 ， H e i l o n g j i a n g ， C h i n a ) Abs t r a c t ：T o s t u d y t h e o p t i mu m e x t r a c t i n g t e c h n o l o g y，t h e me t h o d o f u l t r a s o n i c e x t r a c t i o n we r e u s e d t o e x t r a c t o l e a n o l i c a c i d f r o m q u i n c e，p a r a me t e r s o f t e mpe r a t u r e，t h e r a t i o o f s o l i d t o l i q u i d a n d e x tra c t i o n t i me wa s o p t i m i z e d b y t h e r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y ( R S M) T h e c o n t e n t o f o l e a n o l i c a c i d w a s d e t e c t e d b y H P L C ， t h e o p t i mu m e x t r a c t i n g c o n di t i o n s we r e a s f o l l o ws ：u s i n g wa t e r- f r e e e t h a n o l ，t h e r a t i o o f s o l i d t o l i q u i d 1： 1 6， t e mp e r a t u r e 5 3 o C ，e x t r a c t i n g t i me 4 5 mi nUn d e r a b o v e c o n d i t i o n s ，t he c o n t e n t o f o l e a n o l i c a c i d i n q u i n c e r e a c h e d 0 1 4 Ke y wo r d s：q u i n c e；o l e a n o l i c a c i d；r e s p o n s e s u r f a c e me t h o d o l o gy ；u l t r a s o ni c e x t r a c t i o n；HPL C 作者简介： 孟祥敏( 1 9 8 1 一 ) ， 女( 汉) ， 讲师， 硕士研究生， 研究方向： 天然产物提取研究。 解吸是一个解吸剂与树脂竞争作用的过程， 解吸 过慢 ， 生产周期也会延长； 而解吸过快 ， 解吸剂在还没 有来得及将被吸附在树脂颗粒上的物质带走 ，就已经 离开了树脂颗粒。 因此， 解吸速度过慢或者过快都不利 于解吸。 图9 结果表明， 6 0乙醇以1 5 mL mi n 的流速进 行解吸时， 解吸率较高。 2 3 山茱萸黄酮纯度检测 按纯度检测方法 ， 经计算 ， 原山茱萸提取液 中黄 酮纯度为8 6 6，经A B 一 8 树脂纯化后黄酮 纯度 为 6 7 3 8， 是原纯度的7 7 8 倍 ， 说明大孔树脂技术可以 用于山茱萸黄酮的分离纯化工艺中。 3结论 在所选 的4 中树脂中， A B 一 8 树脂属于快速吸附树 脂， 吸附率和解吸率都较高 ， 用于山茱萸黄酮的纯化较 理想，分离纯化山茱萸黄酮的最佳条件为 ：上样流速 2 0 m L m i n ， 上样浓度为 1 0 m g m L ， 上样量7 0 m L ， 用 1 5 m L m i n 的6 0的乙醇做为解吸剂进行解吸，纯度 测定结果表明， 经A B 一 8 树脂纯化后 ， 山茱萸黄酮的纯 度为6 7 3 8 ， 具有一定的应用价值。 参考文献： 1 】 向继明， 丁楠， 姜立春， 等 山茱萸总黄酮提取工艺的研究叨 农产 品加工 ，2 0 0 7 ， 1 1 ( 3 ) ： 7 5 7 7 2 I 孙金旭， 朱会霞， 王敏， 等 山茱萸保健啤酒的研制f J 】 酿酒科技， 2 0 0 7 ， 1 1 ( 4 ) ： 5 6 5 9 3 】 于智峰， 王敏 大孔吸附树脂在黄酮类化合物分离中的应用叨 中 药 材， 2 0 0 6 ， 2 9( 1 2 ) ： 1 3 8 0 1 3 8 2 4 】4 何伟， 李伟 大孔树脂在中药成分分离中的应用 J 】 南京中医药大 学学报， 2 0 0 5 ， 2 1 ( 2 ) ： 1 3 4 1 3 6 【 5 】 李伯庭， 王湘， 李小进 大孔吸附树脂在天然产物分离中的应用 J 】 中草药， 1 9 9 9 ， 2 1 ( 8 ) ： 4 2 4 _ 4 【 6 】6 杨荚莲， 夏银， 任蓓蕾 大孑 L 树脂对甜荞麦壳类黄酮的纯化研究 J 】 _食品科技，2 0 0 9 ， 3 4 ( 1 ) ： 1 3 5 1 3 9 7 】 周桃英， 罗登宏， 李国庆， 等 A B 一 8 大孔树脂纯化荷叶总黄酮的工 艺研究 J 】 中国食品添加剂，2 0 0 9 ， 9 ( 6 ) ： l 1 4 1 1 9 收稿 日期 ： 2 0 1 1 - 0 4 1 7 - = =3 8 孟祥 敏， 等： 响 应面 法优化木 瓜果实中齐 墩果酸 提取工艺 分离技术 木瓜 ， 属蔷薇科木瓜属植物， 为多年生落叶灌木或 小乔木 ， 是集食用、 药用、 观赏于一体的多用途植物。 中 医认为木瓜有“ 舒筋活络、 健脾开胃、 舒肝止痛” 的药理 作用 】 1 。 现代研究表明， 木瓜富含多种氨基酸及营养元 素， 并含有黄酮、 S O D、 齐墩果酸等多种活性物质2 - 3 1 。 木 瓜的主要药效成分为齐墩果酸， 据文献报道 ， 齐墩果酸 具有消炎抑菌、 降低转氨酶的作用， 还可以促进肝细胞 再生、 防止肝硬化 、 降血脂、 降血糖、 增强机体免疫功 能、 抑制变态反应等 ， 是当前治疗肝炎的有效药物之 一 o 近年来 ， 人们对木瓜果实中齐墩果酸进行研究 ， 但 超声波法提取齐墩果酸的报导较少。 为此， 本文利用超 声波法提取木瓜果实中的齐墩果酸，并利用响应面法 对提取参数进行优化， 对指导生产具有积极的意义。 1 材料与方法 1 1 材料 木瓜干 ：陕西省白河县提供 ；齐墩果酸对照品 ( 9 8) ： 陕西慧科植物开发有限公司。 1 2 仪器与试剂 1 2 1 仪器 D F F 一 5 0 型小型万能破碎机、 1 0 1 0 型电热恒温鼓 风干燥箱、 R E 一 5 2 A A型旋转蒸发仪 ：上海比朗仪器有 限公司； K Q 一 6 0 0 D B 型超声清洗器 ： 昆山市超声仪器有 限公司； S H B H I 型循环水式真空泵 ：郑州长城科工贸 有限公司； L C 一 2 0 A 型高效液相色谱仪 ： 日本岛津公司； J A 2 0 0 3 A 型精密电子天平 ：上海达平仪器有限公司； H H S 1 型恒温水浴锅： 金坛市瑞华仪器有限公司等。 1 2 2 试剂 无水乙醇( 分析纯 ) 、 冰醋酸( 分析纯) 、 三乙胺( 分 析纯) 、 甲醇( 分析纯) 、 甲醇( 色谱纯 ) 等。 2 方法 2 1 木瓜中齐墩果酸的提取方法 将木瓜干粉碎 ， 过3 0 目筛 。 称取木瓜粉 1 g ， 加入 5 0 m L 无水乙醇 ， 在不同条件下超声波提取 ， 抽滤 ， 将滤 液浓缩蒸干。 用甲醇溶解浓缩物并转移 rJ l O m L 容量瓶 中， 定容至刻度 ， 摇匀得样品液。 2 2 单因素试验 2 2 1 乙醇浓度的确定。 称取木瓜粉5 份 ， 每份1 g ， 分别加入5 0 m L 3 0、 5 0、 7 0 、 9 0 乙醇和无水乙醇， 在3 0 下超声波提取 4 0 m i n ， 抽滤 ， 将滤液浓缩蒸干。 用 甲醇溶解浓缩物并 转移到1 0 m L 容量瓶中， 定容至刻度 ， 摇匀得样品液。 将 样品液用0 4 5 m微孑 L 滤膜过滤， 取2 0 L 进样分析。 测 得齐墩果酸含量与乙醇浓度的关系。 2 2 2 料液比的选择 。 称取木瓜粉5 份， 每份1 g ， 分别按料液比1 ： 5 0 、 1 ： 4 0 、 1 ： 3 0 、 1 ： 2 0 和1 ： 1 0 选取浸提溶剂的体积 ，在3 0下以无 水乙醇超声波提取4 0 m i n ， 抽滤， 将滤液浓缩蒸干 ， 以 下操作同2 2 1 ， 测得齐墩果酸含量与料液比的关系。 2 2 - 3 提取时间的选择圄 。 称取木瓜粉5 份 ， 每份1 g ， 加入5 0 m L 无水乙醇， 在 3 0 下超声波分别提取2 0 、 3 0 、 4 0 、 5 0 、 6 0 m i n ， 抽滤， 将 滤液浓缩蒸干， 以下操作同2 2 1 ， 测得齐墩果酸含量与 提取时间的关系。 2 2 4 温度因素的选择嘲 。 称取木瓜粉5 份， 每份1 g ， 加入5 0 m I 水乙醇， 分 别在3 0 、 4 0 、 5 0 、 6 0 、 7 0 以无水 乙醇超声提取4 0 m i n ， 抽滤， 将滤液浓缩蒸干， 以下操作同2 2 1 ， 测得齐墩果 酸含量与提取温度的关系。 2 3 超声波提取工艺的优化( B o x B e h n k e n $ 计) 利用超声波法提取木瓜中齐墩果酸的过程中， 提 取率的高低受多种因素的影响。根据本试验前期的研 究表明 ， 提取溶剂的种类、 浓度 、 提取温度 、 超声时间、 料液比都会对提取率有一定程度的影响。 经比较， 无水 乙醇和甲醇较氯仿、 丙酮提取率偏高， 同时考虑到甲醇 有毒 ， 试验选用无水乙醇作为提取溶剂。 超声波功率对 齐墩果酸提取率影响不大， 试验中确定功率为6 0 0 W。 在此基础上 ， 试验应用相应面法中的B o x B e h n k e n i ,计 对提取温度、 料液比、 超声时间3 个因素进行优化。 试验 设计借助D e s i g n E x p e r t ， 因素的水平及编码如表1 问 。 表 1 Bo x B e h n k e n设计试验 因素水平及编码 Ta b l e 1 Bo x Be h n k e n d e s i g n e x p e r im e n t al f a c t o r a nd c o d i ng 注：编码值与真实值之间的关系为： X I = ( A 一 5 0 ) 1 0 ； X 2 = ( B 一 1 5 ) 5 ； X 3 = ( C 一 4 0 ) 1 0 。 2 4 齐墩果酸的含量测定 2 4 1 色谱条件 A g i l e n t 1 1 0 0高效液相色谱仪 ； U V 一 2 0 7 5 紫外可见 检测器 ； H i Q S i l C 1 8 ( 4 6 m m x 2 5 0 m m) 色谱柱 ； 流动相 为 甲醇 ： 水 ： 冰醋酸： 三 乙胺 ( 8 9 ： 1 1 ： O 0 4 ： 0 0 2 ) ， 流速 ： 0 8 m L m i n ； 柱温 ： 3 0 c 【 ： ； 检测波 长 ： 2 1 0 n m； 进样量 ： 2 0 L。 分离技术 孟祥敏， 等： 响应面法优化木瓜果实中齐墩果酸提取工艺 2 4 2 线性关系考察 精密称取齐墩果酸标准品适量 ， 加入甲醇制成浓 度为0 5 0 m g m L 的齐墩果酸标准液。将标准液浓度依 次稀释为0 2 5 、 0 1 、 0 0 5 、 0 0 2 5 m g m L 。将 以上溶液经 0 4 5 m微孑 L 滤膜过滤， 在2 4 1 色谱条件下进样分析 ， 测定峰面积。 以齐墩果酸浓度为横坐标( ) ， 各浓度对 应的峰面积( 1 ， ) 为纵坐标作标准曲线 ， 其 回归方程为： Y = 2 3 0 6 1 9 2 e 一 0 0 7 X， R 2 = 0 9 9 9 8 1 。齐墩果酸的浓度在 0 0 2 5 mg m L 0 5 m g mL 范围内与峰面积成 良好的线性 关系。 2 4 3 精密度、 重现性及加样回收率试验 对标准品溶液重复进样5 次， 每次2 0 L ， 齐墩果酸 峰面积的R S D 为0 2 5。 取样 品5 份 ， 按样 品液方法制 备 ， 在2 4 1 色谱条件下进样分析 ， 根据峰面积计算出齐 墩果酸的R S D 为1 3 4。称取已测得齐墩果酸含量的 木瓜粉末3 份，每份1 g ， 3 份分别加入齐墩果酸标准品 5 0 、 1 0 0 、 1 5 0 mg ，按样品液方法制备后测定含量 ， 结 果齐墩果酸平均加样回收率为9 8 2。说明在样品处 理过程中齐墩果酸损失量少 、重现性好，仪器精密度 高， 方法可行。 2 4 4 样品液的测定 将2 1 中样品液用0 4 5 m 微孔滤膜过滤 ，在上述 色谱条件下取2 0 L 进样 。 根据标准曲线， 用外标法对 木瓜中齐墩果酸的含量进行定量分析。 3 结果与分析 3 1 响应面数值分析结果 B o x B e h n k e n 设计方案及所得试验结果如表2 。 其 表 2 B o x B e h n k e n设计及试验 结果 Ta b l e 2 Bo x - Be h nk e n d e s i g n a n d e x p e r i me n t r e s u l t 3 9 = I 中A， B， C 分别对应提取温度、料液比和超声时间的因 素水平值 ， 响应值为对应提取条件下齐墩果酸的含量。 利用D e s i g n E x p e r t 软件 ，对上表数据进行二次多 项拟合 ， 得到齐墩果酸提取率与提取温度、 料液比、 超 声时间三因素之间的三元非线性回归方程： Y=I 1 3 - 0 0 4 4 A 00 6 0 0 6 9 C 加 0 3 6 A 0 0 3 2 5 B 一 0 01 4 C + 0 0 5 5 AB+0 0 0 2 5 AC一 0 1 5 BC 式中： y 为齐墩果酸含量 ； A， 日， C 分别为上述三因 素的编码值。 3 2 回归方程各项的方差分析结果 回归方程各项的方差分析结果， 如表3 。 表 3 回归方程方差分析表 Ta b l e 3 Re g r e s s i o n e q ua t i o n a n a l y s i s o f v a r i a nc e t a b l e 从方程的方差分析表3 可以看出，试验所选用模 型显著( P 0 0 5 ) ， 拟合度好 。 方程的回归系数显著性检 验表明，因素B 和C 对齐墩果酸含量的线性效应显著 ， B C 对齐墩果酸含量的交互效应影响显著， 其余因素影 响不显著， 具体见表4 。 表 4 回归方程 系数显著性检验 Ta b l e 4 Re g r e s s i o n e q ua tio n s i g n i fic an c e t e s t 3 3 等高线图和响应面图分析结果 通过回归方程所做 的等高线与其对应的响应面 图见图1 ， 比较3 图可知 ： 料液 比、 超声时间对齐墩果酸 提取率的影响较为显著 ，表现为曲线较陡 ， 其最佳值 分别在1 ： 1 6 和4 5 m i n 左右。 而提取温度对齐墩果酸提取 率的影响不大， 表现为曲线较为平滑 ， 随其含量的增加 或减少， 响应值变化很小， 其最佳值约为5 3 。 综合响应面数值与等高线图分析， 在点( O 3 1 3 0 7 ， 0 3 6 6 1 6 ， 0 5 3 0 6 6 ) 处响应值有最大值 ， 也就是说用无 水乙醇作溶剂 ， 在温度为5 3 1 3、 料液 比为1 ： 1 6 8 3 、 提 - = = = 4 0 盂 祥敏， 等： 响应面法 优化木瓜果实中 齐 墩果 酸提 取工艺 分离技术 DES I GNEXPE Ac t u a l Fa c t o r s ： X =B Y =C Ac t u a l Co ns t a nt A =0 0 0 一 DES I GNEXPERT P Ac t u a l Fa c t o r s ： 一 X A 1 2 Y 一 1 1 Ac t u a l Co n s t a nt s ： B o-o0 0 9 4 兽 O 8 邑 器 00 0 0 0 0 图1 等爵线与其对应的响应面图 Fi g 1 Co n t o u r l i n e a n d r e s p o n s e s ur f a c e s 取时间为4 5 3 1 m i n 时， 齐墩果酸提取率最高。 为方便操 作， 选择温度5 3 ， 料液比为1 ： 1 6 ， 时间为4 5 m i n ， 在此 条件下 重复操作3 次 ，齐墩果酸平均 提取率 达到 1 4 0 mg g ， 也说明了试验设计方法的科学合理性。 4 结论 与讨论 1 ) 目前齐墩果酸含量测定的方法多用 比色法、 薄 层色谱扫描法 8 - 9 ， 本文用高效液相色谱法测定木瓜果 实中的齐墩果酸， 方法操作简单 、 灵敏、 重现性好 ， 可以 用来对木瓜药材中齐墩果酸的含量进行测定。试验过 程 中对 比了不同的流动相 ： 甲醇一 水 、 乙腈一 水 、 甲醇一 乙腈一 水、 甲醇一 0 5 醋酸铵 、 甲醇： 水： 冰醋酸： 三乙胺 溶液【 0 】 等多种流动相体系， 结果发现以甲醇： 水： 冰醋酸： 三乙胺 ( 8 9 ： 1 1 ： O 0 4 ： 0 0 2 ) 作 流动相 ， 同时控制流速 0 8 m Um i n 、 柱温3 0、 检测波长2 1 0 n m、 进样量2 0 L ， 齐墩果酸与其它峰的分离度较高， 可得到满意的色谱图。 2 ) 响应面法需要 的试验次数少、 周期短， 求得的 回归方程精度高， 并且它能同时研究几种因素间的交 互作用。 经响应面法优化得出， 木瓜中齐墩果酸的最佳 超声提取条件为： 温度为5 3 ， 料液比为1 ： 1 6 ， 提取时 间为4 5 m i n 。 通过验证试验 ， 在此条件下齐墩果酸的提 取率达到1 4 0 m g g 。 3 ) 试验结果表明， 木瓜果实中含有生理活性物质一 齐墩果酸 ， 含量达0 1 4。 我国木瓜资源丰富， 因此可 以对木瓜果实中的齐墩果酸进行提取分离，开发生产 具有保健功能的食品、 药品， 以满足市场需求， 同时也 可为生产企业和地方发展带来较好的经济效益和社会 效 益。 参考文献： 1 唐春红， 叶志义， 项昭保， 等 木瓜营养保健作用研究动态 J 】