《基因重组hollidaY》PPT课件.ppt

1,同义突变（same sense or synonymous mutation）：指虽然基因已发生突变，但仍编码同一种氨基酸，这是因为密码子有简并性。 无义突变（nonsense mutation）：是指由于突变而使其某一编码子突变为终止密码子（UGA,UAG，UGG）。 错义突变（mis-sense mutation）：又称歧义突变，是指由于突变而导致多肽链上氨基酸的改变，大多数的突变属于此类。 延长突变（elongation mutation）：这是一类刚好与无义突变相反的突变，是由于终止密码子突变为编码子，使肽链延长。,与突变有关的几个概念,2,回复突变（back or reverse mutation）：是指由突变型四复为野生型的突变。 抑制基因突变（suppressor mutation）：是指一个基因的突变表型可因另一基因的突变而发生改变，后一个基因就称为抑制基因。 突变率（mutation rate）：指在一个世代中或其他规定的单位时间内，在特定的条件下，一个细胞发生某一突变的概率。对于有性生殖的生物，突变率用一定数目配子中的突变配子的比例来表示；细菌的突变率则用一定数目的细胞在分裂一次过程中发生突变的次数表示。能常多细胞生物的突变率高于单细胞原核生物。,BACK,与突变有关的几个概念,3,碱基类似物指与DNA分子中碱基结构十分相似的化学物质。当DNA复制时，这些类似物可以掺入到DNA分子中而引起误配，例如溴尿嘧啶（5-BU）以酮式存在时可与配对，以烯醇式存在时可与配对，从而导致转换的发生。同时，有5-Bu引起的突变也可以由再诱发回复突变。 2-氨基嘌呤也有类似的情况。,（1）碱基类似物,4,（1）碱基类似物,5,（1）碱基类似物,6,A、复制时空位的相对位置上出现而引起转换,II：烷化剂：这是一类带有一个（单功能烷化剂）或几个（多功能烷化剂）不稳定的烷基，可与核酸中的碱基起化学反应的物质。大多数烷化剂可在鸟嘌呤的第七位上产生烷化作用，形成烷基鸟嘌呤。烷基鸟嘌呤很不稳定，可以脱去烷基而恢复原状，也可以使核糖鸟嘌呤间的共价键断裂而脱去鸟嘌呤。脱去鸟嘌呤的位置上便形成一个空位，这一空位有以下几个可能的效应： ,（2）碱基修饰剂（改变DNA结构的诱变剂）,7,B、复制时，在空位的相对位置上出现或，引起颠换： C、导致断裂，引起染色体畸变成移码突变。 也可能并不脱去烷基鸟嘌呤，但由于烷基嘌呤的存在使碱基错配而导致点突变。,（2）碱基修饰剂（改变DNA结构的诱变剂）,8,（2）碱基修饰剂（改变DNA结构的诱变剂）,9,（2）碱基修饰剂（改变DNA结构的诱变剂）,10,吖啶类化合物（如原黄素等）：这一类诱变剂的特点是诱发移码突变，使分子增加或缺失几对核苷酸。,（3）DNA插入剂（结合到DNA上的化合物）,BACK,11,光复活作用（photo reactivation）：经UV照射后的细菌等细胞如果暴露在可见光下时，存活数显然大于在黑暗中培养的同一处理物。这是因为细胞中含有一种可见光激活的酶，称光复合酶。这种酶可与经UV照射过的的黑暗中结合，如果经可见光激活便可将二聚体分开来，同时酶脱离。 光复活过程已在细菌、酵母、原生动物、哺乳动物乃至人类细胞中发现。,二、损伤的修复,12,二、损伤的修复,光复活作用修复,13,暗复活（dark reactivation）： 又称切补修复（excision repair），所谓的暗复活是指修复的损伤并不需要光的激活作用，而不是指修复过程必须在暗中进行。这一过程大约有四个酶参与，即首先由核酸内切酶的作用下在损伤部位造成单链断裂，然后在核酸外切酶的作用下切除二聚体及周围的少数几个核苷酸，而后在DNA pol I或的作用下修补缺口，最后由连接酶连接成一个完整的双链。,二、损伤的修复,14,暗复活修复,二、损伤的修复,15,重组修复（recombination repair）：重组修复是在DNA复制的情况下进行的，所以又称复制后修复。过程大致是： （）复制：带有二聚体的单链仍可做为模板进行DNA复制，但是子代DNA链中在与二聚体对应的部位出现空隙。 （）重组：有缺口的子代DNA链与另一完整的母链进行重组，空隙由母链来的片段弥补而将空隙转移给母链。 （）再合成：重组后，空缺已不再对着二聚体部位，而是面对着另一正常的单链，此时在多聚酶和连接酶作用下便可完成修复过程。,二、损伤的修复,16,这种重组修复并没有从亲代中除去二聚体，在以后的复制中还必须经过重组修复的过程。但是随着复制的继续，损伤的链将在群体中逐步“稀释”。,二、损伤的修复,重组修复,17,DNA损伤修复的缺陷：DNA损伤修复的缺陷将带来严重的后果。可导致细胞的突变，甚至死亡。人的DNA损伤修复的缺陷也将带来多种疾病。 如着色性干皮病（xeroderma pigmentosum,XP）是一种常染色体隐性遗传病（AR）。该病的病人是因为与DNA损伤修复相关的基因突变引起的，90%的病人在20岁之前就已经发生了皮肤癌。,电离辐射引起的DNA损伤和它的修复：请同学们学！,二、损伤的修复,18,DNA重组大致可分为三大类型： 一是同源重组(homologous recombination)：这是指依赖于大范围同源顺序之间的联会，联会和重组部分不受限制； 二是非同源重组：指依赖于小范围同源顺序的联会，联会仅限于某些特定的核苷酸序列，而重组也仅发生在这里，故又称位点专一重组(site-specific recombination)； 三是异常重组(illegitimate recombination)：指没有同源顺序的联会而发生的重组。,第四节 重组,19,If normal rules of meiosis apply:- 1. Should be 4 red : 4 yellow in ascus 2. Pairs of spores should have same color (as formed by mitosis),Whats going on ?,20,异常分离与基因转变（abnormal segregations and gene conversion ),1940年，Mitchell注意到上述现象，设计了实验进行分析： 吡哆醇依赖型突变： pdxp pdx ,585个子囊,21,好象是一个基因转变成为另一个基因，其邻近的基因仍然是2：2分离,22,介绍四分子分析时，可以看到一个子囊中的八个子囊孢子成直线排列，比例为：，而且是两两成对的。但是以后的研究中发现一些不规则的分离现象，即5：3；：（或：），不规则：（不是两两成对）等。例如在粪生粪壳菌中，野生型黑色子囊孢子与突变型灰色子囊孢子的杂交（g+g-），曾发现： 5：3 占0.06 6：2 占0.05 不规则： 占0.008,（一）、基因转变（gene conversion）,23,5：3 6：2 不规则4：4,（一）、基因转变（gene conversion）,24,1930年温克勒把不规则分离的现象解释为减数分裂过程中同源染色体联会时一个基因使相对位置上的基因发生相应的改变所致，因而他提出了基因转变（有时亦称为基因转换）的概念。 基因转换：指由一个基因转变为其相应的等位基因的现象。,（一）、基因转变（gene conversion）,25,以后又发现一个基因发生转变时它两旁的基因（侧翼标记）常同时发生重组，所以认为基因转变是某种形式的染色体重组的结果。例如A g+a g-的杂交（是一对关于接合型的基因）。 g+和g-可以发生转变，而且凡是g+或g-发生转变。都伴随着和之间的重组。 由于基因转变常伴随着重组的发生，所以基因转变机制的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。,（一）、基因转变（gene conversion）,26,A g+a g-,（一）、基因转变（gene conversion）,27,这是R.Holliday 1964年提出的一个关于基因重组的模型。 (a)联会；(b)两个染色单体双链分子中各一条单链为核酸内切酶切断；（c）单链游离端移动；(d)游离端交换位置；（e）单链连接成为半交叉；(f)半交叉位置移动成十字型结构；（g）两臂旋转；(h) 上下两个单链由限制性内切酶切断；(i) DNA连接，中间包含杂合双链的两条染色单体，两旁基因（和，和之间）发生了重组。,引入：Holliday模型,28,2.两个DNA分子单链的同一部位发生断裂。,Homologous DNA pairs,2. Nicks made near Chi (GCTGGTGG) sites by a nuclease.,(二)同源重组的Holliday模型,29,3.两个断裂的单链的游离末端彼此交换,3. ssDNA carrying the 5 ends of the nicks is coated by RecA to form RecA-ssDNA dilaments.,(二)同源重组的Holliday模型,30,4.末端彼此连接形成Holliday连接体,4. RecA-ssDNA filaments search the opposite DNA duplex for corresponding sequence (invasion).,重组接点Recombination joint,(二)同源重组的Holliday模型,31,5. Branch migration(分支迁移),异源双链heteroduplex,4. form a four branched Holliday structure,接合分子 joint molecule,(二)同源重组的Holliday模型,32,(二)同源重组的Holliday模型,33,(二)同源重组的Holliday模型,34,6.Holliday连接体异构化、拆分,(二)同源重组的Holliday模型,35,6. Resolving Holliday junction,36,Holliday模型,37,Holliday模型,38,Holliday模型,39,1染色单体转变（chromatid conversion)：减数分裂的4个产物中，有一个产物发生了基因转变所以称染色单体转变，出现6：2(或2：6)的子囊。 2半染色单体转变(halfchromatid conversion)：5:3(或3：5)或3:1:1:3的子囊则表明在减数分裂的4个产物中，有一个产物的一半或两个产物的各一半出现基因转变，称半染色单体转变。因为5:3或3:1:1:3的分离中，基因转变只影响半个染色单体，分离一定发生在减数分裂后的有丝分裂中，所以又称减数后分离。,（二）、基因转变的类型,40,（二）、基因转变的类型,41,（三）、基因转变的分子机制,42,（三）、基因转变的分子机制,43,Holliday模型中的杂合双链部分必须得到校正： （1）如果在减数分裂后的有丝分裂DNA合成前得到校正，那么将产生正常的：分离或：分离； （2）如果没有及时得到校正而留到下一轮DNA复制而产生两个非杂合的双链，那么将产生：或不正常的：分离，我们将这种没有及时校正而下一轮复制时才被校正的现象称为减数后分离。,（三）、基因转变的分子机制,44,（三）、基因转变的分子机制,45,Heteroduplex,Mismatch repair mechanisms may fix the unmatched base pair,Mismatch repair may correct to the wild type or mutant strand,gene conversion,（三）、基因转变的分子机制,46,（三）、基因转变的分子机制,47,正常分离4：4,（三）、基因转变的分子机制,48,染色单体转变,（三）、基因转变的分子机制,49,半染色单体转变,（三）、基因转变的分子机制,5:3 或 3:5,50,4：4或3：1：1：3,半染色单体转变,（三）、基因转变的分子机制,51,（三）、基因转变的分子机制,52,（1）两个杂种分子均未校正复制后出现异常的4：4(或3：1：1：3)的分离。,（1）由于不配对的碱基没有得到修复校正，杂种DNA留到下一次复制。在下一次复制即减数分裂以后的复制中，异源双链DNA复制形成两个不同的等位基因通过有丝分裂发生分离。减数分裂的4个产物中的两个染色单体的各12出现基因转变，即仅仅影响DNA双链中的一条镀，实际只影响两个单体中的半个染色单体，即DNA双链中的各一条链。显然转变的链与未转变的链的分离一定是在减数分裂后的有丝分裂中发生。因而这类基因转变属于半染色单体转变或减数后分离，子囊袍子的异常分离比为3：1：1：3。,（三）、基因转变的分子机制,53,（2） 5：3(或3：5)的分离。,（2）一个杂种分子校正为+，或校正为g时，则发生另一种类型的半染色单体转变，前者修复后出现5：3的分离，后者子囊孢子的异常分离比为3：5， 由图8-8B可见，减效分裂4个产物中的一个产物(第3条染色单体成第2条染色教体)的tA出现转变。由于只影响半个染色单体，所以转变的链与末转变的链将在减数分裂后的有丝分裂中发生分离。 综合上述两种修复情况可见，半染色单体转变是当两个杂种分于都未进行修复校正或一个。,（三）、基因转变的分子机制,54,(3) 6：2的分离; (4)正常4:4的分离,（3）两个杂种分子都被校正到+(或g)时,修复后出现6：2(或2：6)的异常分离。这便是出现染色单体转变的起因。 （4）当两个杂种分子都按原来两个亲本的遗传结构进行修复时，则减数分裂4个产物恢复成GC、GC 、AT、AT的正常配对状态，子囊抱子分离正常，呈现4：4的结果。,（三）、基因转变的分子机制,55, 细菌的转化或接合过程，供体都是以单链后双链状态进入细胞，但单链参与重组的，所以它的重组显然不同于真核生物的同源重组。 细菌的转导不同于转化或接合过程，它是双链DNA进入受体细胞，并且是双链参与重组的。,二、细菌的同源重组（自学）,56,二、细菌的同源重组（自学）,57,二、细菌的同源重组（自学）,58,噬菌体的非同源重组以噬菌体研究得最多，也了解得最深入。噬菌体与宿主的重组（整合）有赖于DNA上的一小段称为attP的核苷酸顺序和宿主DNA称为attB的核苷酸顺序，以及编码的整合酶（int基因产物）和某些与宿主重组有关的，由宿主编码的酶。 attB和attP的长度都比较短，attB约25bp，由核心顺序O及旁侧顺序B及B组成。attP稍长些，约200bp，由核心顺序O及旁侧P及P组成。核心顺序长15bp，这一顺序是重组的位点（前头所指处） 。 核心顺序：GCTTTTTTATACTAA,三、噬菌体的非同源重组（位点转一重组）,59,三、噬菌体的非同源重组（位点转一重组）,60,三、噬菌体的非同源重组（位点转一重组）,61,异常重组主要发生在转座因子及反转录病毒的重组。 转座因子的转座有两中途径复制转座和非复制转座。 复制转座（replicative transposition）是指转座时复制一份拷贝而后插入新的位置。有转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）参与。原核生物的转座因子一般以这种方式进行转座。,四、异常重组,62,非复制转座（non- replicative transposition）是指转座因子从原来位置上转座到新的位置。是切离与转座同时进行的，该种转座只需转座酶的参与，真核生物的转座因子一般以这种方式进行转座。 非复制转座还有一种特殊的类型，称为保留转座（conservation transposition），这种转座也是切离与转座同时进行，但它类似与噬菌体的整合过程，出现这种转座方式的转座因子一般都比较大，而且转座往往连同宿主的一部分DNA一起转座。,四、异常重组,63,第六节 转座遗传因子,转座因子（transposable elements）：能从同一染色体的位置上转到另一位置，也能转到不同的染色体上的DNA序列。转位时会使那个位置附近的基因活性和结构发生变化。 病毒、细菌、和真核细胞的质粒或基因组中含有转座子。多数转座子在插入新位点的过程中依赖其特异的插入序列去完成。转座子插入后可影响所在位置的基因的表达,64,一、 原核生物的转座因子,二、 真核生物的转位因子,三、 转座机理,四、转座的遗传学效应,第六节 转座遗传因子,65,转座子（Transposon，Tn）：指能将自身插入基因组中一个在序列上无关的新位点的DNA序列。 病毒、细菌、和真核细胞的质粒或基因组中含有转座子。多数转座子在插入新位点的过程中依赖其特异的插入序列去完成。转座子插入后可影响所在位置的基因的表达。,第六节 转座遗传因子,66,一、 原核生物的转座因子,1、插入序列（insertion sequence） IS因子是自主的单元，每种IS因子在序列上是不同的，但是都有共同的组构形式。每种IS因子都具有短的反向末端重复序列；当IS因子转座时，插入部位外的一段宿主DNA序列倍增，通过比较插入前后靶部位序列，发现了其倍增的本质，在插入的位点上，ISDNA的两侧总有一很微不足道的同向重复序列(在这里同向只表示同一序列的2个拷贝以相同的方向重复，并不是具有2个邻接的重复)。但在未被插入的基因中(启先插入)靶部位只有重复序列的单一拷贝。一些特定IS因子的同向重复序列长度是不变的(转座机子里的一种反映)。同向复复序列的一般长度为9bp。,67,1、插入序列（insertion sequence）,68,五十 年代在日本的医院中发现了细菌性痢疾的病原菌对许多抗生素具有抗性 ，还能转移到其他敏感痢疾菌中。对医学是可怕的，对遗传学研究是有意义的，是由抗性质粒引起的。 转座子是一类具有抗性的可移动的遗传因子，它的抗性基因两侧具有 IS因子便于识别和转移。转座子应包括转座子基因和两侧的IS因子。,2.转座子 （Transposon),69,复合转座子转座子除了与转座有关的功能外，还携带药物抗性(或其他)标记。这些转座子以Tn和数码来命名。其中一类是由携带药物标记的中央区域和两侧的臂(arms)组成的复合因子(composite elements)。两个臂进由相同或(更经常的)相反方向的相同的或高度同源的IS序列组成。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。大部分情况下，这些转座子的转座能力是由IS序列决定和调节的。,2.转座子 （Transposon),70,BACK,2.转座子 （Transposon),71,五十年代，Mc Clintock在研究玉米时发现了转位因子。,二、 真核生物的转位因子,转座子是美国女遗传学家McClintock研究了玉米的Ac-Ds系统后提出的概念。 现象：玉米籽粒有色（红、紫），但有一些籽粒出现花斑及条纹，花斑有大有小。早期有颜色者，花斑大，后期有色者，花斑很小。,72,1Ds因子：解离因子，能在玉米基因组内移动，它的存在会使染色体上该位置发生断裂的机会增加，并由此改变邻近基因的表达。当Ds因子插入到玉米颗粒色素基因C的近旁或中间时，就不能形成色素，当Ds转位离开后，C基因所受的抑制作用会解除，玉米又出现色素。,二、 真核生物的转位因子,73,2Ds因子不稳定，它受另一调控因子Ac的影响 Ac的存在能解除Ds对色素基因C的抑制作用,使C基因表达，颗粒出现色素斑点; Ac激活因子丢失，Ds趋于稳定，抑制了C基因的表达，玉米颗粒呈无色。,二、 真核生物的转位因子,74,玉米调控因子的作用模式： (a) Ac激活因子的位置不稳定，在无Ds转位因子时，C基因不受抑制，颗粒呈深色。(b) 当Ds因子插入C基因时，C的色素表型受到抑制。(c) 每当Ds转位后，C基因又可表达颗粒出现斑点。(d) 无Ac激活因子时，Ds能稳定插入到C基因中，使颗粒为无色。 由于Ds和Ac两因子频繁转位，使玉米颗粒上出现散在斑点。,BACK,二、 真核生物的转位因子,75,以细菌的转座子为例 (1) 切开: 转座酶有两种功能:A.识别受体靶点。从5端切开，产生两个粘性末端。B.识别自身两边的