课件：二蛋白质生工.ppt

第二章 蛋白质 Proteins,一、氨基酸 二、肽 三、蛋白质的结构 四、蛋白质的性质 五、蛋白质的功能,主要内容,1结构,一、氨基酸 Amino Acids,氨基酸：羧酸分子中烃基上的氢原子被氨基取代的产物。,生物体内常见氨基酸的分类,蛋白质氨基酸： 蛋白质中常见的20种氨基酸，都是L-型。 稀有的蛋白质氨基酸：常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸存在于结缔组织的纤维状蛋白质中。 非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨基酸。有些是重要的代谢中间物，如瓜氨酸、鸟氨酸等。,2分类,参与蛋白质构成的氨基酸中，有20种氨基酸出现频率高，直接作为合成蛋白质的构件分子，有自己的密码子，称为标准氨基酸。 按照氨基酸侧链的极性和电荷情况，将20种蛋白质标准氨基酸分为5组：,蛋白质标准氨基酸,非极性、脂肪族侧链氨基酸组,非极性、芳香族侧链氨基酸组,极性、不带电荷R侧链组,带负电荷R侧链组,带正电荷R侧链组,二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号,非标准氨基酸,有300多种，研究越来越深。 4-羟脯氨酸，-氨基谷氨酸，-氨基丁酸； D-氨基酸； 鸟氨酸，瓜氨酸尿素循环的中间产物,两性解离和等电点 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化,-,氨基酸的性质,调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的NH3 +基和COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。 对于一氨基、一羧基氨基酸：pI = (pK1+ pK2 )/2 pK1为-羧基解离一半时溶液的pH。 pK2为-氨基解离一半时溶液的pH。,对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR )/2 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR )/2,当pH=pI时，氨基酸净电荷为0，在电场中不移动。 当pHpI时，氨基酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。 当pHpI时，氨基酸分子带正电荷，在电场中向负极移动。,(1)-氨基与甲醛的反应氨基酸的甲醛滴定法,化学反应,(2) 桑格反应,多用来鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸,二硝基氟苯法（DNFB法）分析N末端,蛋白质末端的游离氨基与DNFB（称为sanger试剂）反应后，生成DNP-蛋白质。 由于DNFB与氨基形成的键对酸水解的稳定性远远比肽键高，因此， DNP-蛋白质经酸水解后，只有末端氨基酸以黄色的DNP-氨基酸衍生物的形式存在，其余的都是游离氨基酸。 所以，只要鉴别所生成的DNP-氨基酸，就知道蛋白质的N末端残基。,（3）艾德曼反应与PITC的反应,多用于重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”。,PITC法分析N末端,PITC与蛋白质的末端氨基反应，生成PTC-蛋白质。 PTC-蛋白质在酸性有机溶剂中加热，N末端的PTC-氨基酸发生环化，并从肽链上掉下来，剩下的肽链部分仍然是完整的。 可采用层析、气相色谱、高效液相色谱的方法对反应液中的PTC-氨基酸进行检测。 可用于测定氨基酸的顺序。,巯基反应,涉及二硫键的生成、打开和保护,茚三酮的反应,Pro产生黄色物质，其余为蓝紫色。在570 nm（蓝紫色）或440 nm（黄色）定量测定（g）。,氨基酸的光学活性与构型,氨基酸的紫外光谱性质,氨基酸在可见光区没有吸收，在红外区和远紫外区都有光吸收。 在近紫外区（200-400nm），酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸有特征吸收峰。,氨基酸的分离分析,分配柱层析 纸层析 薄层层析 离子交换柱层析,离子交换柱层析的原理,结合蛋白质=蛋白质+辅基（配基）,分类,蛋白质的结构与功能,蛋白质的结构与功能,酶催化作用、运输和贮藏、细胞运动、 机械支撑、免疫保护,蛋白质一级结构,一个氨基酸的-氨基与另一个氨基酸的-羧基之间失水形成的酰 胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。 蛋白质：由氨基酸以肽键相连而成的生物大分子化合物。,肽基的特征,肽基具有刚性平面结构：氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共 轭作用；组成肽键的原子处于同一平面。 肽基具有极性 肽基具有反式构象,多个氨基酸通过肽键按顺序连在一起形成多肽链，每个氨基酸单位称为残基。 多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。 如上述五肽可表示为：AlaGlyTyrGlyTyr,多肽链的方向性及大小,多肽链由一条主链和多个R基侧链组成， 两个分子氨基酸所形成的肽称为二肽，三个氨基酸缩合成的肽称为三肽。 若一种肽含有少于10个氨基酸，则为寡肽，超过此数的肽统称为多肽。,多肽链的立体结构,生物体内有些寡肽或多肽的含量尽管很低，但具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：谷胱甘肽；缬氨霉素；脑啡肽；抗菌肽等等。,活性肽,谷胱甘肽（GSH）,GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物。 广泛存在于动物肝脏、血液、酵母和小麦胚芽中，各种蔬菜等植物组织中也有少量分布。 谷胱甘肽具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。,酸味肽,酸味肽与酸味和Umami味有关。 Umami味具有谷氨酸钠的味道，由含有谷氨酸钠盐和天冬氨酸钠盐的二肽或三肽组成。 从木瓜蛋白酶处理的牛肉提取物中分离出来的八肽，被称为“美味肽”，是代表Umami风味最好的例子，具有典型的牛肉汤味道。,抗菌肽,通常与抗生素肽和抗病毒肽联系在一起，如短杆菌肽、杆菌肽、多粘菌素、乳酸杀菌素、枯草菌素和乳酸链球菌肽等。热稳定性较好，具有很强的抑菌效果。,蛋白质的氨基酸顺序具有特异性,DNA核苷酸顺序决定mRNA的核苷酸顺序 mRNA的核苷酸顺序决定蛋白质的氨基酸顺序。,一级结构,蛋白质的一级结构，是指氨基酸在肽链中的排列顺序及二硫键的位置，是多肽链具有共价键的主链结构。,多肽链的氨基酸顺序，是蛋白质生物功能的基础。,维系蛋白质一级结构的主要化学键是肽键和二硫键。 蛋白质的一级结构决定了蛋白质的性质、空间结构和生物学功能。,蛋白质的构象：蛋白质分子中各原子和基团在三维空间所构成的特定空间结构。 朊病毒 蛋白质的二级结构是指肽链的主链在空间盘曲、折叠所形成的构象。不涉及侧链基团的空间排布。,二级结构,肽键的键长介于C-N单键和双键之间，具有部分双键的性质，不能自由旋转。 肽键中的四个原子和它相邻的两个-碳原子处于同一平面，形成了酰胺平面，也称肽键平面。 在酰胺平面中C=0与N-H呈反式。,多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以碳原子相隔。 C-C键和C-N键是单键，可以自由旋转，其中C-C键旋转的角度称，C-N键旋转的角度称。 和这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位置，也就决定了肽链的构象。,螺旋,多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54 nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15 nm 。 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。 -螺旋中氨基酸残基的侧链基团伸向螺旋外侧。 蛋白质分子为右手-螺旋。,-螺旋中原子的线性排列,-螺旋的稳定性,在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，-螺旋就不稳定，这是由于静电排斥，无法形成链内氢键。 在多肽链中只要出现pro，-螺旋就被中断，因为Pro的C参与R基的形成， C-C键和C-N键都不能旋转，同时也无法形成链内氢键。 Gly的R基太小，难以形成-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。 肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成-螺旋。,() 折叠, -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。两个氨基酸之间的轴心距为0.35 nm；,2019/8/6,48,可编辑,() 非重复性二级结构,-转角是指蛋白质的分子的多肽链经常出现180的回折，在回折角上的结构就称-转角，也称发夹结构，或称U形转折。 由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的NH之间形成氢键。 这类结构主要存在于球状蛋白分子中。 -转角经常出现在连接反平行-折叠片的端头。,无规则卷曲,无规则卷曲,细胞色素C的三级结构,是指没有规律性的肽链结构，但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里。,环,普遍存在于球状蛋白质中的一种二级结构，形状象希腊字，所以称环。 总是出现在蛋白质分子的表面，而且以亲水残基为主，这种结构与生物功能有关，另外在分子识别中可能起重要作用。,蛋白质超二级结构,由若干个相邻二级结构形成的具有一定规律的组合体称为超二级结构。,角蛋白,角蛋白是组成动物皮层和皮肤衍生物的结构蛋白质，其中由-螺旋结构组成的称为-角蛋白，可构成毛发、鳞、角、蹄、爪等。 角蛋白具有很强的抗牵张性能，在动物体内起保护作用。 -角蛋白：含有大量的半胱氨酸残基，在二级结构（-螺旋）之间形成大量的二硫键。,与-角蛋白有关的生活常识,毛料衣服被虫蛀的原因: 蛾幼中的消化液中有含有大量的硫醇，使毛料中-角蛋白的二硫键被还原，肽链之间的聚合被解除，肽链被消化。 化学烫发的原理: 烫发剂有两种，一类是含有巯基还原剂，一类是氧化剂。先用还原剂破坏巯基，并采用物理方法使毛发卷曲，再用氧化剂恢复二硫键，使卷曲固定。,三级结构,蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上，一条多肽链借助各种次级键折叠成的具有特殊肽链走向的紧密构象。 次级键主要有疏水作用力、氢键、离子键和范德华力等。 多肽链折叠成三级结构之后，疏水氨基酸残基多集中于分子内部，亲水氨基酸残基多分布在分子表面。,在比较大（含有200个以上氨基酸残基）的蛋白质三级结构中，往往会出现一个以相对独立的紧密结构区域，称为结构域。 最常见的结构域约含40-400个残基。 不同的结构域具有专一性的作用。 结构域之间的肽链称为铰链区。,结 构 域,细胞内，蛋白质生物合成过程中即伴随多肽链的自发折叠，有的是自发快速完成，有的需要分子伴侣的辅助才能完成; 在体外，多肽链的折叠要慢得多。 多肽链中的疏水氨基酸残基相互挤在一起排开水，亲水氨基酸残基位于分子表面，形成比较稳定的天然构象。 形成蛋白质特定天然构象的信息来源于蛋白质的一级结构，一级结构决定高级结构。,多肽链的折叠,蛋白质的变性,天然蛋白分子受到某些过激的物理因素或化学因素的影响时，次级键会被破坏，导致天然构象解体，生物活性丧失，这个过程称为蛋白质的变性。 对于单一蛋白质，如果变性条件不剧烈，除去变性因素，蛋白质还可恢复其天然构象和生物学活性，这种现象称为蛋白质的复性。,变性的因素,物理因素: 高热、高压、紫外线、X-射线、超声波等。 化学因素: 强酸、强碱、重金属盐、三氯乙酸等。有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸胍）、重金属盐等。,蛋白质+涩柿子（单宁酸） 柿石 误食重金属，可用牛奶解毒,蛋白质变性，常有下列现象出现：,生物活性的丧失是蛋白质变性的主要特征。 溶解度降低，扩散系数降低，黏度增加，对蛋白酶的水解更加敏感。,肌红蛋白的结构与功能,必须具备在低氧环境中可逆结合氧的能力,蛋白质的四级结构,两条或多条具有三级结构的多肽链以球状亚单位形式缔结在一起，形成一个有功能的聚集体形式，这种聚集体形式称为四级结构。,四级结构中的每个亚单位成为亚基，由相同亚基组成的蛋白质称为同聚体，不同亚基组成的称为异聚体。 各亚基主要通过非共价键缔结在一起，其中疏水作用贡献最大，范德华力最小，氢键和离子键提供了亚基间特异性结合的作用力。,组成蛋白质氨基酸的-碳原子是不对称的，由极性多肽链折叠而成的亚基也是手性分子，但具有四级结构的蛋白质分子往往具有对称性。,蛋白质的变构效应,血红蛋白的变构现象 血红蛋白是一个四聚体蛋白质，具有氧合功能，可在血液中运输氧。研究发现，脱氧血红蛋白与氧的亲和力很低，不易与氧结合。一旦血红蛋白分子中的一个亚基与O2结合，就会引起该亚基构象发生改变，并引起其它三个亚基的构象相继发生变化，使它们易于和氧结合，说明变化后的构象最适合与氧结合。 结论：只有当蛋白质以特定的适当空间构象存在时才具有生物活性。,变构效应（别构效应）：多亚基蛋白（或酶）因某效应物与之结合而导致自身的构象和活性发生改变的现象。 蛋白质结构决定其功能，蛋白质一级结构的变化，有时甚至是一个氨基酸残基的改变，也有可能引起蛋白质分子构象的改变，从而使蛋白质失去正常功能。,蛋白质的性质,(一) 蛋白质酸碱性质 (二) 蛋白质溶解度 (三) 蛋白质大小和形状 (四) 蛋白质胶体性质 (五) 蛋白质免疫化学性质,蛋白质的酸碱性质,- 氨基，- 羧基，侧链上的氨基、羧基、咪唑基、胍基、羟基、巯基等的解离,蛋白质的胶体性质,蛋白质溶液属于胶体溶液，具有一定的稳定性，一般不会发生凝聚而形成沉淀，原因如下： 蛋白质分子表面有许多极性基团，可以吸附水分子，在蛋白质分子表面形成连续的水化层，阻止蛋白质分子彼此靠近形成沉淀； 蛋白质溶液远离等电点pI，带同种电荷，彼此排斥，能阻止蛋白质发生凝集。,蛋白质的免疫化学性质,蛋白质可以作为抗原，刺激脊椎动物引起的抗体是蛋白质。 抗体也作为抗原制备二抗。,蛋白质的分离纯化,(一) 溶解度差异 (二) 分子大小差异 (三) 电荷不同 (四) 吸附特性 (五) 生物分子特异性亲和力,根据溶解度差异分离蛋白质,等电点沉淀 盐溶与盐析 有机溶剂沉淀：改变介电常数，破坏蛋白质表面水化层 蛋白质变性沉淀：升温、三氯乙酸,根据分子大小差异分离蛋白质,透析与超滤,密度梯度离心,蔗糖密度梯度蔗糖浓度从离心管底部至顶部逐渐降低，将蛋白质溶液加在梯度介质顶端进行超离心，蛋白质颗粒的质量和密度越大，沉降速度越快，不同蛋白质颗粒各自形成“差速区带”，随着超离心的进行不断下移，从而逐渐分开。,凝胶过滤层析,固定相内一定大小的网孔对不同分子质量的蛋白质的阻滞作用不同，从而进行分离。 大分子蛋白质先流出，小分子蛋白质后流出。 凝胶过滤层析.mov,根据电荷不同分离蛋白质,丙烯酰胺凝胶电泳：垂直板，不连续系统 浓缩效应、电荷效应、分子筛效应 溴酚蓝作指示剂 电泳技术.mov,等点聚焦电泳,在电泳凝胶中加入两性电解质（带有氨基和羧基、pI分布在一定范围内的低分子寡聚体混合物），施加电场后，各组分移动并停留在各自的等电点位置；等电点低的靠近阳极，等电点高的靠近阴极，形成一个连续的pH梯度。 蛋白质属于两性电解质，在凝胶中移动到对应的等电点区域时，可停留在那里形成很窄的区带。,双向电泳,在二维方向上对同一蛋白质样品先后进行两种不同性质的电泳，提高蛋白质电泳的分辨率。 先将蛋白质样品在一维方向进行等电点聚焦凝胶电泳，使蛋白质按等电点分离成条带；然后在换用SDS-PAGE在二维方向电泳，使位于同一条带中的蛋白质按分子质量展开。,蛋白质的离子交换层析,与氨基酸的离子交换层析基本原理相同，流动相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换。 蛋白质所带电荷的种类和数目不同，与层析介质的结合力不同。首先用大量洗脱剂洗出未结合的杂蛋白，然后逐步提高洗脱剂离子强度（或改变pH），结合在凝胶上的蛋白质按照结合力从弱到强的顺序依次洗脱下来，分布收集洗脱液，即可获得分离的蛋白质。,根据蛋白质吸附特性分离蛋白质,利用介质表面的活性基团对流动相中不同组分吸附性能差异进行分离，当蛋白质颗粒接触到比表面积大的固体颗粒物质时，会受到表面基团的吸引而停留下来。 不同蛋白质分子表面的极性与非极性氨基酸残基的数目、比例及分布不同，与固体颗粒物质的吸附作用力也就不同。,根据生物分子特异亲和力分离蛋白质,首先将特异配基共价连接到惰性凝胶（如葡萄糖、琼脂糖）等颗粒上制成亲和层析介质。 当蛋白质混合物流经亲和层析介质，只有目标蛋白能与配基结合；用缓冲溶液洗脱除去未结合的杂蛋白，最后改变洗脱条件，把目标蛋白给洗脱下来。,蛋白质鉴定,蛋白质分子质量鉴定SDS-PAGE SDS（十二烷基硫酸钠）是蛋白质变性剂，可破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，使蛋白质发生变性；在-巯基乙醇存在下，蛋白质二硫键断裂，多肽链充分伸展，SDS与蛋白质的侧链通过疏水作用形成复合体。SDS与大多数蛋白的结合比（质量比）是1.4:1，相当于2个氨基酸残基结合1分子SDS.,SDS与蛋白质的结合，使蛋白质带上大量负电荷，原有的电荷差异可以忽略不计， SDS与蛋白质的结合，使蛋白质的构象变成椭棒状。 在SDS存在下，蛋白质在电场的泳动时其迁移率仅仅与蛋白质分子质量有关。,lgM=a-b M蛋白质的分子质量 a