课件：离心机操作及血液样本处理.pptx

实验基础技能培训,李玉涛 2017-07,Part 1 血液基本成分及其分离方法 Part 2 离心机简介及使用,Part 1 血液基本成分及其分离方法,一、血液基本成分 二、血液物理性质 三、血液采集常用方法 四、血液成分分离方法,一、血液基本成分,血细胞形态、数量、比例和血红蛋白含量的测定称为血像。患病时，血像常有显著变化，故检查血像对了解机体状况和诊断疾病十分重要。,1、红细胞,红细胞（erythrocyte，red blood cell）直径78.5m，呈双凹圆盘状，中央较薄（1.0m），周缘较厚（2.0m） 红细胞的这种形态使它具有较大的表面积（约140m2），便于携O2和部分CO2。 成熟红细胞无细胞核，也无细胞器，胞质内充满血红蛋白（hemoglobin, Hb）。 红细胞的渗透压与血浆相等，使出入红细胞的水分维持平衡。当血浆渗透压降低时，过量水分进入细胞，细胞膨胀成球形，甚至破裂，血红蛋白逸出，称为溶血（hemolysis）,2、白细胞,白细胞（leukocyte, white blood cell）为无色有核的球形细胞，体积比红细胞大，能作变形运动，具有防御和免疫功能。,白细胞分类,光镜下，根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞两类。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种。,2.1、中性粒细胞,中性粒细胞（neutrophilic granulocyte, neutrophil）占白细胞总数的50%70%，是白细胞中数量最多的一种。具有活跃的变形运动和吞噬功能。 细胞呈球形，直径1012m，核染色质呈团块状。核的形态多样，有的呈腊肠状，称杆状核；有的呈分叶状，叶间有细丝相连，称分叶核。,中性粒细胞异常,中性粒细胞增高见于： a急性感染和化脓性感染：肺炎、败血症、脓肿等。 b组织损伤：大手术后、心肌梗塞、肺梗塞等。 c恶性肿瘤：急、慢性白血病、淋巴瘤等。 d各种中毒：尿毒症、糖尿病酸中毒等。 中性粒细胞减少见于： a某些传染病：流感、伤寒、付伤寒、麻疹。 b某些血液病：再障、粒细胞缺乏症、白细胞减少症。 c化疗或放疗后，抗癌药物，X线及镭照射。 d其它：脾功能亢进，自身免疫性疾病，高度恶病质。,2.2、嗜酸性粒细胞,嗜酸性粒细胞（eosinophilic granulocyte, eosinophil）占白细胞总数的0.5%3%。与变态反应有关，并有吞噬抗原抗体复合物的作用。 细胞呈球形，直径1015m，核常为2叶，胞质内充满粗大（直径0.51.0m）、均匀、略带折光性的嗜酸性颗粒，染成桔红色。,嗜酸性粒细胞异常,嗜酸性粒细胞增多见于： a变态反应性疾病：支气管哮喘、药物过敏、荨麻疹等。 b寄生虫病：蛔虫病、钩虫病、血吸虫病。 c某些皮肤病：湿疹、牛皮癣、剥脱性皮炎等。 d某些血液病：慢粒、恶性淋巴瘤、嗜酸性粒细胞性白血症等。 嗜酸性粒细胞减少见于： a应用糖皮质激素、促肾上腺皮质激素。 b伤寒、副伤寒等病患者。,2.3、嗜碱性粒细胞,嗜碱性粒细胞（basoophilic granulocyte, basophil）数量最少，占白细胞总数的00.15。 细胞呈球形，直径1012m。胞核分叶或呈S形或不规则形，着色较浅。胞质内含有嗜碱性颗粒 嗜碱性粒细胞主要参与特殊的免疫反应。,嗜碱性粒细胞异常,增多见于： a慢性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病。 b某些转移癌及骨髓纤维化。 减少一般无临床意义。,2.4、淋巴细胞,淋巴细胞（lymphocyte）占白细胞总数的20%30%，圆形或椭圆形，大小不等。 T细胞约占淋巴细胞总数的75%，参与细胞免疫，如排斥异移体移植物、抗肿瘤等，并具有免疫调节功能。 B细胞约占血中淋巴细胞总数的10%15%。B细胞受抗原刺激后增殖分化为浆细胞，产生抗体，参与体液免疫。,淋巴细胞异常,增多见于： a某些病毒或细胞所致的传染病：传染性淋巴细胞增多症、传染性单核细胞增多症、传染病恢复期、结核病、百日咳。 b淋巴细胞性白血病、白血性淋巴肉瘤。 减少见于： a应用肾上腺皮质激素、接触放射线。 b细胞免疫缺陷病、某些传染病的急性期。,2.5、单核细胞,单核细胞（monocyte）占白细胞总数的3%8%。具有游走性和吞噬作用。 单核细胞为白细胞中体积最大的细胞。直径1420m，呈圆形或椭圆形。胞核形态多样，呈卵圆形、肾形、马蹄形或不规则形等。胞质较多，呈弱嗜碱性，含有许多细小的嗜天青颗粒,单核细胞异常,增多见于： a某些感染：伤寒、结核、疟疾、黑热病、亚急性细菌性心内膜炎。 b某些血液病：单核细胞性白血病、淋巴瘤、骨髓异常增殖综合症、恶性组织细胞病。 减少一般无临床意义。,二、血液物理特性,血液密度为 1.0501.060103kg/m3， 红细胞的密度为 1.090103kg/m3， 血浆的密度为 1.0251.030103kg/m3。,2019/8/6,19,可编辑,血液的颜色,通常抽的是静脉血，所以外观看上去呈暗红色。 若血含较多的是高铁血红蛋白或其他血红蛋白衍生物，则呈紫黑色。 血浆（或血清）因含少量胆红素，看上去呈透明淡黄色； 若含乳糜微粒，则呈乳白浑浊； 若发生溶血，则呈红色血浆。,三、血液采集常用方法,红色试管帽采血管 采血管中不含任何添加剂，适用于常规生化血清检验，对检验结果无影响，缺点：离心不到位或者温育时间不够，容易形成纤维蛋白，容易堵塞设备针孔,三、血液采集常用方法,紫色试管帽采血管 采血管中含EDTA-K2抗凝剂，一般采取喷雾制作，使得抗凝剂均匀分布管壁，制备标本为全血，一般适用于常规的血液学检测,常用抗凝剂（1）,乙二胺四乙酸二钠（简称EDTANa2） 抗凝原理：可螯合血液中的钙离子而阻止血液凝固。 优点：抗凝作用强，且不改变血细胞的形态和体积，可防止血小板聚集。 应用：适于血液学检验，但输血不能用。 草酸盐合剂（草酸钾及草酸铵合剂） 抗凝原理：夺取血中的游离钙而形成不溶解的草酸钙，而达到抗凝。 优点：溶解度大，抗凝作用强。 缺点：草酸钾使红细胞缩小约6，而草酸铵可使红细胞膨胀。 应用：适于除红细胞压积容量测定的血液检验。,常用抗凝剂（2）,枸橼酸钠（柠檬酸钠） 抗凝原理：与血中游离钙离子形成非离子化的可溶性的枸橼酸钙复合物，从而阻止血液凝固。 优点：与血中游离钙离子结合松散。 缺点：引起水及无机盐在血细胞及血浆之间分布的改变。 应用：常用于血沉淀及输血时的抗凝，不适用于血液化学检验。 肝素 抗凝原理：阻止血中的凝血酶原转变为凝血酶，防止血凝。 优点：抗凝作用强，不影响红细胞的大小，对血液化学分析干扰少。 缺点：价格贵，抗凝时间短，其抗凝血做白细胞分数计数时，白细胞着色不佳。 应用：血液有机成分、无机成分的分析。,四、血液成分分离,1 血清血浆分离 2 白细胞分离 2.1 裂解红细胞法 2.2 Ficoll分离法,1、血清血浆的分离,血清和血浆的最大区别就是血清中不含纤维蛋白原 紫色采血管颠倒混匀后，1200g 离心10min，4度，取上清。 红色采血管需用枪头搅匀后，1200g 离心10min，4度，取上清,2.1、白细胞分离-裂解红细胞法,红细胞裂解液主要成分：NH4Cl， KHCO3， Na2EDTA 红细胞裂解液裂解原理：氯化铵通过在其细胞膜进行氢氧根碳酸氢根和氯离子的交换，改变其渗透压，造成红细胞胀大破裂；外周血淋巴细胞受影响较少因其细胞膜的离子转运通道不同。,2.1、白细胞分离-裂解红细胞法,主要实验流程： 将10X储存液稀释到1X工作浓度； 加入血沉棕黄层的6-10倍体积的1X红细胞裂解液，吹打均匀 冰上裂解10分钟。裂解完毕后，50ml离心管中液体应呈透明红色，且下方无红色沉淀。 1500g，10min，4度离心，弃去上层液体，仅保留下层白色沉淀。,2.2、白细胞分离- Ficoll分离法,原理: 常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.0770.001 的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin) (FH)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量为400,000，不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。,2.2、白细胞分离- Ficoll分离法,Part 2 离心机简介及使用,/experiment/628/629/47523.htm,1、离心机简介,离心机 借助转轴高速旋转产生离心力，使不同密度、不同大小的物质分开，能达到初步分离纯化的目的，是实验室必不可少的仪器。 按照转速可以分为低速(50000)三种类型。根据体积大小和摆放位置又可分为台式离心机 和落地式离心机。台式离心机体积比较小，常是中低速离心机 ；落地式离心机体积较大，常带有降控温装置，大多是高速离心机 。,2、离心机的摆放,离心机一般放在干燥、避免阳光直射的地方。 离心机散热量比较大，周围不要堆放杂物，四周离墙壁、挡板等不透气、散热性差的物品至少10cm以上。 离心机尽量单独放在一个房间，周围绝对不要放有机试剂、易燃品,3、离心机使用注意事项,根据实验所需和使用的离心管，含有有机试剂的液体要用特殊的离心管； 选择合适的转头，转速绝对禁止超过转头标明的最高转速。 离心管的对称放置和重量配平，同时应该注意离心管和转头可以承受的最大重量的溶液，液体最多装离心管全体积的3/4。,4、离心机保养,每次使用完毕，都要将离心机盖儿打开，使得热量或者水气自然蒸发，如之前使用了低温离心，可能有结冰，则要等冰融化，及时用干燥棉纱布擦洗干净，等无明显水汽时再盖上盖子。 如果离心机转头可以替换，则每个转头使用完毕后都要及时取出，用干净的、干燥的医用纱布擦洗干净，倒扣放置，切勿使用锐器刮擦。 操作人员离开时候要切断电源。,5、具体操作流程（1）,1. 设定使用温度 （通常为4）后，先把离心陀放入离心舱中，注意离心陀要卡好轴心；关上舱门，离心舱的温度开始下降，预冷时间要充足。 2. 把样本装入适当的离心管，双双用天平平衡重量，盖上离心管盖子并旋紧。 1） 注意离心管只装七成满，虽然加有盖子，但也可能因离心力太强而外泄。 2）离心管通常都会放在碎冰上，注意取出平衡时，要把碎冰的液体擦拭干净。 3）落单的离心管要用另一只装有清水的离心管平衡。 3. 把平衡好的离心管对称地放入离心陀中，盖上离心陀的盖子，注意有无旋紧。 4. 关上离心机舱门，在仪表板上调好所要的转速与时间。 5. 确定所有步骤无误后，按Start 钮开动，离心机渐渐加速，此时要密切监控。 1）如在运行中听到不正常声音或者闻到什么异味，应立即采取刹车，按“停止”键，必要时还要切断电源。 2）仪器运行期间，绝对禁止打开离心机盖 3）等到离心达到所要的转速后，确定一切正常才可离去,5、具体操作流程（2）,6. 完成离心时，要等离心陀完全静止后，才能打开舱门；请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，以及沉淀的位置。 1）若不慎将上清和沉淀混在一起，就要重来一次。 2）若离心管有漏，要找出原因，并且立刻清理离心陀