课件：第7章-基因治疗.ppt

第七章 基因治疗,7.1 基因治疗的概念和策略 7.2 基因治疗的载体 7.3 重要疾病的基因治疗,2,7.1 基因治疗的概念和策略,以DNA和RNA为诊断材料，利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断的方法。 1、内源基因的变异 2、外来生物的入侵,基因诊断（ Gene diagnosis ）,基因结构的异常 基因致病 基因表达的异常,3,基因诊断常用技术,核酸分子杂交： PCR： 生物芯片： DNA芯片或基因芯片 基因测序：,4,血友病A基因诊断,病因：factor VIII 基因缺陷（碱基取代、缺失或插入等），使凝血因子VIII 无活性或不稳定，导致凝血障碍。 PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段 Bcl I 限制酶：酶切位点在 基因内18号外显子3端 电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断,感染性疾病的基因诊断,5,基因治疗（gene therapy） ：指以正常的基因替代或修补病人细胞中的缺陷基因从而达到治疗疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的手段之一。（狭义） 广义：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。,基因治疗,基因工程操作都在体外完成，基因治疗需将基因导入人体细胞，所以在有效性和安全性方面要求更高。,6,鸟氨酸转氨甲酰酶,7,基因治疗的发展,美国，世界上开展基因治疗最早的国家。1990年9月14日，第一例正式批准的基因治疗实验开始进行，4岁ADA缺陷病人 2009年，佛罗里达大学三位患有Leber先天性黑矇(LCA)2型的遗传性盲患者 中国：1991年7月开始进行基因治疗临床实验，血友病B，因子治疗后浓度上升，出血症状减轻,取得了安全有效的治疗效果。,8,9,基因治疗： 生殖细胞(germ cell)基因治疗 体细胞(somatic cell)基因治疗：骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞等，随机整合,10,7.1.1 基因治疗的途径与策略,基因治疗途径： 体外基因治疗（ex vivo）：是将含外源基因的表达载体导入人体自身或异体细胞，经体外细胞扩增后输入人体。 体内基因治疗（in vivo）：是将含外源基因的真核细胞表达载体直接导入人体内。 已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病扩大到获得性疾病。,11,基因治疗的两种途径,载体,目的基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,12,基因治疗的总体策略,1、基因矫正（修正）（gene correction）：未实现 2、基因置换 （gene replacement）： 3、基因修饰（增补）（gene augmentation）： 4 、基因激活（gene activation）： 5 、基因失活（干预）（gene interference ）：反义核酸、核酶、RNAi 6 、药物敏感疗法：“自杀基因”的应用：旁观者效应 7 、免疫基因治疗 8、耐药基因治疗,自杀基因的作用机制,13,7.1.2 基因治疗基本程序,基因诊断：利用多种基因检测技术如限制性片段长度多态性分析（RFLP）、PCR扩增靶序列法和人类基因库搜寻法等对人体病变基因进行定位。 基因分离：指利用DNA重组技术克隆、鉴定、扩增和纯化用于治疗的基因，并根据病变基因的定位，与特异性整合序列和基因表达调控元件进行体外重组。,14,载体构建： 病毒型载体：腺病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、反转录病毒载体等，它是基因治疗中使用的主要载体； 非病毒型载体：脂质体载体和多聚阳离子载体等。 基因转移： 体内疗法：病毒颗粒直接注射法、重组DNA分子直接注射法、呼吸道吸入法、基因枪转移法和电穿孔法等。 体外疗法：病毒转染法。,15,7.1.3 基因治疗的现状与问题,恶性肿瘤 64.6%，心血管8.9%，艾滋病7.9% 美国63.4%，欧洲27%，日本与澳大利亚1.1%和1.8%,16,17,基因治疗理论和技术上的挑战,1.缺乏更多更好的治疗基因： 2.缺乏高效特异的基因导入系统：转移效率、特异性 靶向载体 3.治疗基因表达缺乏可调控性：包括空间上的可调控性和时间上的可调控性。 4.表达水平低 5.随机整合带来的问题,18,基因治疗社会伦理学上的挑战,治疗的安全性问题 基因治疗模式与现有伦理道德的冲突。,19,7.2 基因治疗的载体,7.2.1 逆转录病毒载体 7.2.2 腺病毒载体 7.2.4 单纯疱疹病毒,20,7.2.1 逆转录病毒载体,正链RNA病毒 5 gag- pol- env 3 (编码核心蛋白)(逆转录酶)(编码病毒包膜蛋白) 病毒感染细胞后，逆转录成双链DNA，整合在染色体上，以此合成病毒基因及RNA，装配成病毒颗粒。,21,逆转录病毒载体优点： 1、基因组小而简单，可随机整合 2、感染效率高 3、侵染范围广 4、原病毒稳定拷贝数低 5、对宿主细胞无毒副作用 6、10 kbDNA 缺点： 1、仅转染分裂期细胞；2、随机插入的风险,22,ADA-Gene + vector （逆转录病毒） 重组分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 回输患儿体内 12月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%,基因治疗基本过程 例1,23,逆转录病毒载体 +FcDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3 导入仓鼠细胞（CHO ）F表达； 导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）F表达； 91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）回植病人皮下F基因表达，F基表达水平达正常人的5%。,我国学者薛京伦实施的F的基因治疗，是我国基因治疗成功的例子。,基因治疗基本过程 例2,24,25,7.2.2 腺病毒载体,腺病毒（Adenovirus，Adv）：一类20面体病毒 含一个线形双链DNA分子（Ad-DNA），35kb左右，从成熟的病毒颗粒中分离的DNA具有传染性。 两端具有反相重复序列（IRT），5端共价结合一种蛋白（TP）分子。 Ad-DNA从病毒颗粒中释放的时候，依靠TP自行环化。,26,腺病毒载体优点： 1、易于制备、培养、纯化和浓缩 2、转化效率高 3、晚期启动子强，表达水平高 4、可感染分裂与非分裂细胞 5、不整合到基因组中 6、可在呼吸道和肠道中繁殖 缺点： 1、短暂表达；2、免疫原性强；3、载体基因组复杂，装载容量小；4、缺乏组织特异性,27,7.2.4 单纯疱疹病毒,单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）:嗜神经性病毒 潜伏、激活,28,7.3 重要疾病的基因治疗,7.3.1 遗传病的基因治疗 7.3.2 肿瘤的基因治疗 7.3.3 艾滋病的基因治疗,29,用于基因治疗的基因包括三大类： 正常基因：置换、弥补；遗传性分子疾病 反义基因（基因干预）：获得性分子疾病 自杀基因：是编码能杀伤癌变细胞的酶蛋白基因。,30,7.3.1 遗传病的基因治疗,1、重症联合免疫缺陷（SCID）：体液免疫和细胞免疫联合缺陷 ADA基因隐性突变 2、血友病B：IX因子 3、囊性纤维化（cysticfibrosis,CF ）,31,4、心血管病的基因治疗,心脑血管病包括：单基因遗传病、多基因遗传病 单基因遗传病：家族性高胆固醇血症、遗传性心肌营养不良、遗传性心肌扩张等。 多基因遗传病：高血压、动脉粥样硬化、心肌肥厚、梗塞性血管病、心功能不全等。,32,7.3.2 肿瘤的基因治疗,1 抑癌基因治疗 2 针对癌基因的基因治疗 3 肿瘤的免疫基因治疗 4 针对耐药基因治疗 5 自杀基因治疗肿瘤,33,1 抑癌基因治疗,肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程。 主要是因为抑癌基因的失活与癌基因的激活。,34,抑癌基因p53： 正常细胞内主要抑制细胞生长周期，抑制细胞分裂和诱导细胞凋亡。 正常细胞中p53半衰期短，含量低。 肿瘤细胞中p53表达量增加，但多数没有活性。 p53是至今临床发现的与肿瘤发生相关率最高的抑癌基因。,35,2 针对癌基因的基因治疗,反义癌基因治疗：同源mRNA互补 是通过封闭癌基因、抑制癌基因的过度表达而实现的。利用反义癌基因与肿瘤细胞内癌基因mRNA等结合，减少癌基因的表达或调整癌基因表达的比例。 RNA干扰（RNAi）：siRNA 核酶（Ribozyme）技术：,36,37,3 肿瘤的免疫基因治疗,肿瘤发生后免疫功能下降的原因： 肿瘤细胞免疫性不强 抗原递呈细胞不能提供足够的共刺激信号 机体免疫因子分泌不足,38,为何会得癌症？ 为何基因修饰瘤苗具有抗癌作用？ 制备方法？ 安全性好,39,基因修饰瘤苗,在恶性肿瘤的治疗过程中，常常会出现手术后复发或肿瘤向远处转移的情况。 将外源基因导入肿瘤细胞，改变细胞的致瘤性和增强免疫原性，有利于被机体T淋巴细胞识别，并激发特异性细胞毒反应，从而消灭肿瘤细胞。 这种以外源基因修饰的肿瘤细胞称为瘤苗，目前采用的外源基因多数是细胞因子基因。,40,基因修饰瘤苗基因治疗过程,41,4 针对耐药基因治疗,多药耐受（multiple drug resistance，MDR）：指肿瘤细胞接触某一抗癌药物产生耐药的同时，也对其它结构和功能不同的药物产生交叉耐药性。 MDR1，P-gp：跨膜整合糖蛋白,42,自杀基因：是一类前体药物酶转化基因、药物敏感基因或酶-前体药物激活基因。 主要存在于病毒、细菌或真菌等微生物细胞中。 自杀基因系统：包括一种酶和一种前体药物，通过酶活性的表达将对人体细胞无毒性的前体药物转化为对细胞有很高毒性的物质。 HSK-tk,5 自杀基因治疗肿瘤,43,THE EDN!,44,逆转录病毒载体特点： 1、可整合到染色体中 2、表达时间长 3、可感染分裂细胞,45,外来基因风险多大 由于目前进行基因替换时，正常基因在染色体上的整合并不能保证绝对精确，因此在安全性上有一定的风险。法国几年前发生的SCID-X1（严重