课件：实验四酶联免疫吸附试验ELISA.ppt

实验四 阻断酶联免疫吸附试验 （阻断ELISA),免疫标记技术,定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP,免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.原理,（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接。 （2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,3.常用种类,直接法（direct ELISA）： 将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体 检测抗体 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 阻断法（Block ELISA) ： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体 检测液相中的可溶性抗体,（1） 直接法测定抗原 A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量抗原量。,（2）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体； D. 加底物。测定底物的降解量抗体量。,（3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。,（4）竞争法测定抗原 A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,2019/8/7,10,可编辑,（5）阻断法测定抗体 本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。 A. 将抗原吸附在固相载体表面; B.先加待检血清（抗体）, 形成抗原-抗体复合物; C. 再加酶标单抗； D. 加底物。,酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),4. 原理（以ELISA为例）：,显色,酶标单抗,酶标单抗,实验材料,猪伪狂犬病毒（PRV） 抗原 阴性对照 阳性对照 样品 待测猪血清 HRP标记猪PRV单抗 酶标单抗 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB（四甲基联苯胺） ，底物缓冲液，30% H2O2，新鲜配制 酶标板，酶标仪,阻断法测定猪伪狂犬病病毒ELISA抗体 定性检测,实验方法,1.抗原的处理：,2.包被抗原：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,4，湿盒内，18h,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,3.加待测血清,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.加单抗：,37，湿盒内，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,各孔加入酶标单抗100L/孔,37，湿盒内，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色，10min,6.观察结果,实验方法,1、取已包被猪伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检血清11稀释后加入板孔中，每孔加100l。同样11稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，每孔100l。另设一空白对照孔，空白对照孔加100l稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37温育30分钟。 2、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。 3、每孔加酶标单抗100l，置37温育30分钟。 4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。切记每次在干吸水纸上拍干。 5、显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50l)，混匀。室温（18-25 ）避光显色10分钟后。 6、终止：每孔加终止液1滴(50l) （0.25% 氢氟酸），终止反应。 7、10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值0.35为阳性 8、结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差0.4。 S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值 如果S/N比值0.6，样品判定为PRV抗体阳性。 如果S/N比值0.7但 0.6，样品重测。 如果S/N比值 0.7，样品判定为PRV抗体阴性,具体操作步骤,预期结果,阴性：显色为蓝色 阳性：无色,常用酶及底物,注意事项,1、ELISA实验前血清样品尽量做到37灭活30分钟。 2、在ELISA的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，每加一层