微生物遗传变异与育种.ppt

Chap.7 微生物遗传变异和育种,微生物遗传学研究意义 1） 微生物学的主要分支 2）为生命遗传现象的解释提供依据 3）是分子生物学发展的基础学科 4）促进工业微生物菌种的选育和疾病 的控 制,.1 遗传变异的物质基础,一、证明遗传物质的三个典型实验,-细菌转化实验 -噬菌体感染实验 -植物病毒的重建实验,1、细菌转化实验 - 动物试验,-细菌培养实验 S（死）+R（活） S（ 少量活） +R（活） S（无细胞提取液）+R（活） S（ 少量活） +R（活）,-细菌培养试验（Avery，1944）,2噬菌体感染实验,3植物病毒的重建实验,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,（一）七个水平,1、细胞水平,-细胞核的数目：单核、多核 放线菌菌丝多核，孢子单核 真菌菌丝、孢子部分多核 -核质体的数目：杆菌2个，球菌1个,2细胞核水平,遗传物质,类型,核染色体,（核基因组）,原核生物：核质体无膜包裹，呈松散无定形状态。,真核生物：核内DNA与组Pro结合，有核膜包裹。,核外染色体,（广义质粒）,真核生物,原核生物,的质粒,细胞质基因：线粒体、中心体、叶绿体、,的“质粒”,酵母菌：2m质粒,共生生物（草履虫放毒者品系）：卡巴颗粒,F因子、R因子、Col质粒,Ti质粒,巨大质粒、降解性质粒,3染色体水平 染色体的数目、结构、倍数 原核生物：多数单条、双链、环状、闭合； 少数多条、线状 真菌（含酵母）：多条、线状；单倍体 少数营养细胞、性结合阶段为双倍体,4核酸水平 种类：多数DNA；部分病毒为RNA 结构：多数双链；少数病毒单链 大小： 状态：,细菌染色体结构,基因调控系统,操纵子,调节基因,启动基因，操纵基因,结构基因,5基因水平,6. 密码子水平:遗传信息单位 7.核苷酸水平：最低的突变单位和交换单位,（二）原核生物的质粒,质粒： 游离原核生物染色体外，独立复制， 小型共价、环状、闭合dsDNA分子， 即 cccDNA。,质粒的特点 1）大小： 大质粒： 60kb、1/cell 小质粒： 10-20/cell,2）自主复制能力：,-严紧型 ；松弛型,3）转移性：,Tra区基因：,附加体：某些质粒既可整合进宿主染色体，又可与染色体脱离，称之。,4）质粒的消除： -理化因子 -原生质体诱导法,5）不相容性： 两种亲缘关系相近的质粒不能稳定地存在于同一个细胞中。,（G-菌的部分不相容群）,质粒的遗传表型 1） F质粒（致育因子） Tra区：编码转移相关 蛋白；合成性纤毛,2）R质粒（抗药因子） -RTF基因（抗性转移因子） -抗性决定子 （抗抗生素、抗药、抗种金属）,3）Col质粒（大肠杆菌素因子） -产大肠杆菌素 细菌素：由细菌质粒编码产生的只能 抑制或杀灭近缘细菌或同种 不同菌株的蛋白质。 Col质粒类型： -非接合型：松弛型 -接合型：严紧型,4）Ti质粒：合成冠瘿碱、大型质粒 5）Ri质粒：产生根毛、大型质粒 6）巨大质粒：1000kb 7）降解质粒：降解、接合,8）致病性质粒： -肠毒素、内毒素（E.Coli） -溶血素、肠毒素（S.aureus） 9）共生固氮质粒： -结瘤基因（nod） -固氮基因（nif） 10）隐蔽质粒：未有明确表型,工程质粒-pBR322 主要特点： 1）分子量小 2）稳定、松弛型复制 3）可大量扩增 4）容易分离 5）可携带小于10kb外源DNA 6）多个单一酶切位点 ； 7）带有2个选择标记 8）容易转化,利用选择标记鉴别携带外源片段的转化子 (双抗菌素对照筛选）,.2 基因突变和诱变育种 一、基因突变 野生型菌株：从自然界分离获得的菌株， 称之为。 基本培养基：满足野生型菌株生长最低营 养要求的合成培养基。,（一）突变类型 营养缺陷型：野生型菌株由于突变而丧失 了 某种营养合成能力，而无法在基本培 养基上生长的变异类型。 表示： 基 因：his+，his - ； 表 型：His + ，His -,抗性突变型：野生型菌株由于突变而产 了对某些化学药物或致死物理因子抗性 变异类型。 表示： 基 因： strr、strs； tetr、tets； 表 型：Str r ， Str s,条件致死突变型：某些菌株或病毒经基因 突变后，在某种条件可生长并实现表型，而 在另一条件却无法生长繁殖的突变类型。 温度敏感突变株 形态突变株 抗原突变株 产量突变株,突变株的表型 -选择性突变株：营养缺陷型、抗性 突变型、条件致死突变型 -非选择突变株：形态、抗原、产量 突变型,（二）突变率及其捡出 突变率：某一细胞在每一世代中发生突 变的几率。常用单位群体中每一世代产 生的突变株的数目来表示。,突变率的计算及突变株的捡出 -营养缺陷型 -抗药性突变 -回复突变,（三）基因突变的自发性与不对称性 突变的自发性：基因可自发产生突变。 （辐射、自身有害物质、碱基配对错误） 突变的不对应性：突变性状与引起突变 的原因无直接对应关系。,平板影印培养试验,（四）基因突变及其机制 1、点突变：单个或少数几个碱基的改变。 1）碱基置换 -转换 -颠换,错义突变 无义突变 同义突变,直接引起置换： 亚硝酸、亚硝基胍、羟胺、烷化剂 间接引起置换： 碱基类似物,2）移码突变 DNA序列中插入或缺失少数核苷酸，从而使该处后面遗传密码的阅读框架发生改变的突变。,2）染色体畸变 DNA分子的大段损伤，包括缺失、重复、 插入、易位（转座）和倒拉等。,转座：DNA分子通过非同源重组方式， 从染色体的某一部位转移到另一部位的 现象。,转座因子：凡具有转座作用的DNA序列 均称之。 特点： -转座作用 -末端重复序列 -转座酶基因,转座因子类型,转座机理,转座子的遗传效应 1）插入突变 2）DNA重排,（复制型转座）,（五）紫外线对DNA的损伤及其修复,1损伤的机理： 形成胸腺嘧啶二聚体 2、修复作用 1）光复活作用 光解酶-二聚体复合物为光激活,2.暗修复作用（dark repair）：,3、重组修复 4、SOS修复,二、 突变与育种 （一）自发突变与育种(定向培育） （二）诱变育种,1、基本原则（应考虑的问题） 1） 诱变剂的选择,诱变剂效果的测定-艾姆斯试验 （同时可用于三致物质的检测）,2）出发菌株 3）诱变菌株的状态 -处理单胞（孢）悬液 -选择单倍体或单核细胞 4）剂量：低剂量；表示方法 5）提高检出效率 -利用形态特征 -鉴别培养基,利用鉴别培养基检出突变株 -蛋白酶高活性菌株的检出 （酪蛋白为N源，加HgCl2观察透明圈） -淀粉酶高活性菌株的检出 （淀粉为C源，加I2液观察透明圈） -有机酸高产菌株的检出 （培养基加CaCO3观察透明圈）,6）设计高效的 筛选方案 -初筛（数量、 定性） -复筛（质量、 定量） 7）创新性的 筛选方法,2、营缺型的筛选 （1）三种基本培养基 基本培养基- :满足野生型菌株生长 最低营养要求的组合培养基。 完全培养基+ ：满足所有营缺型菌株 生长营养要求的天然培养基。 补充培养基A，B ：满足相应营缺型 菌株生长营养要求的组合或半组合培养 基。,（2）三类遗传型个体 野生型：从自然界分离获得的菌株不论 营养状况如何，均称为。（A+B + ） 营缺型：野生型菌株经诱变由于代谢障碍， 而必须添加某种物质才能生长的突变株。 （A+B - ） （A-B + ） 原养型：营缺型回复突变后的菌株。 （A+B + ）,基本基 完全基 补充基 野生型 + + + 营缺型 + + 原养型 + + +,（3）筛选步骤 1）诱变 2）淘汰野生型：抗生素法、菌丝过滤法 3）检出： 夹层培养法；限量补充法 逐个检出法；影印平板法,夹层培养法,（4）鉴定缺陷型(生长谱法) 1）制备基本 培养基； 2）加充分洗 涤菌悬液； 3）加待测营 养物； 4）观察生长。,定位（点）诱变,.3 基因重组 基因重组（遗传重组）： 两个独立基因组内的遗传物 质，通过一定的途径转移到一起， 形成新的稳定的基因组过程。,遗传工程 -基因重组技术 经典、同源、生物自然属性、 体内 -DNA重组技术： 分子水平、同- 异源、体外,一、原核生物的基因重组 （一）转化 受体菌直接吸收供体菌游离的DNA 片段而获得部分遗传性状的现象。,1、转化的基本条件 （1）感受态：受体菌最容易接受外源DNA 片段并能实现转化的一种生理状态。 影响因素： -遗传因素（种属的特异性；感受态因子） -外部因素（CAMP、聚乙二醇、二价阳 离子-低温低渗CaCl处理、培养条件）,转化频率：0.11%（很低），最高10%，质粒 为良好的转化因子。 浓度：10-5 ug/ml,结构：一般转化因子都是线状双链DNA，少数为 线状单链DNA。,大小：每一转化DNA片段分子量约 1107， 约占 染色体组0.3%，平均 15个基因。,（2）转化因子,转化因子,2、转化过程 1）酶解和吸收单链 2）同源区配对、 整合 3）复 制 4）形成转化子,5.转染(Tranfection) 提纯的病毒DNA或RNA进入宿主细胞并增殖出正常的病毒后代现象。 -原核生物遗传学慨念 -不同于正常的噬菌体感染、也不同 于转化,1、普遍转导 完全缺陷噬菌体对供体任何DNA小片 段进行“误包”,而将其遗传性状传递给受体菌的现象，包括完全普遍转导和流产 普遍转导两种类型。,完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介,使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。,（二）转导,完全普遍转导,流产普遍转导：,经转导进入受体菌的供体菌DNA片段，在受体菌内不交换、整合、复制，也不迅速消失，仅进行转录、翻译、性状表达转导现象。,、局限转导 部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定的基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象。,A、低频转导（） ）噬菌体感染 ）诱导裂解 ）不正常切离 （ dgal、 dbio） ）形成局限转导子,B、高频转导（） 1）概念 低频转导裂解物：溶源噬菌体感染后，带有 少数局限转导噬菌体的细胞裂解物。 双重溶源菌：同时感染有正常噬菌体 和缺陷噬菌体的受体菌。 来源：LFT裂解物以高的感染复数感染宿主,双重溶源菌,2）高频转导：在局限转导中，用双重溶源 菌诱导后产生的高频转导裂解物转导受体菌 可获得的高达 50% 的转导子，称之。 3）过程： 1）双重溶源菌 2）诱导，获得高频转导裂解物 3）高频转导裂解物感染受体菌,（3）溶源转变,温和噬菌体 感染宿主后，宿主通过 溶源化而获得免疫性以外新性状的现 象。 白喉毒素： 白喉杆菌的-噬菌体带有“TOX”基因,（三）接合 接合：通过细胞间的直接接触,由质粒 介导的遗传物质转移的现象. 接合子：通过接合而获得新性状的受 体细胞。,四种接合型菌株 1、F -,2、 F+ 菌 株,3、Hfr菌株：高频重组菌株， F+整合在染色体上 成为附加体的状态，若与F -接合，有很高的重组 频率。 1）细胞接触 2）Hfr断裂、 转移、 复制 3）接合中断 4）形成接合子,利用接合中断法绘制染色体图谱,4、