原位杂交与凋亡检测技术.ppt

原位分子杂交技术,原位杂交 (in situ hybridization,ISH) 是应用已知碱基顺序并带有标记的核酸探针与组织、细胞中的待测的核酸按碱基配对的原则进行特异的结合而形成杂交体。,再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带有颜色的杂交信号，在显微镜下进行细胞内定位。,DNA-DNA; RNA-DNA; RNA-RNA 人工合成寡核苷酸-DNA(RNA),常用方法： 膜上杂交：用醋酸纤维膜和尼龙膜等作为 载体，将靶基因转移到膜上，然后用探针 进行杂交，阳性结果显示为条纹或斑点。,液相杂交：以生物素或丫啶翁酯标记探针在溶液中用羟基磷灰石层析或吸附、亲和吸附、磁珠吸附等方法进行杂交，结果于计数器，光度计或用化学发光测定。,原位杂交：在具有明确的结构基础上， 如一个细菌，一条染色体，细胞或组 织上进行核酸杂交，可以检测到特定 基因的准确定位。,原位杂交技术的出现是组织化学和免疫组织化学的革命性突破。,一、 原位杂交的分子生物学基础： （一） 核酸的分子结构： C 、H、 O、 N、 P* 核酸水解多聚核苷酸水解核苷、磷酸水解戊糖、含氮碱（碱基）、磷酸。,（二）核酸的一级机构： 碱基共同成分： 腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)； 区别：DNA含有胸腺嘧啶(T)；RNA含有尿嘧啶(U)。,（ 三 ）核酸的高级结构：根据碱基配对规律 DNA：多核苷酸链可形成双螺旋三、四股螺旋；但有高温变性，低温复性的特点。RNA：多核苷酸链一般以单链存在，仅有时局部形成小双螺旋结构。,二、 原位杂交的发展史： 1 、1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue 首创用爪蟾核糖体基因探针与卵母细 胞杂交，杂交点定位于核仁。同年， Buongiorno-Nardelli等用同位素标记 核酸探针对细胞和组织进行定位。,2、1970年Orth 用3H标记兔乳头状瘤病毒cRNA探针在冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出细胞中的病毒DNA。,3、1981年Bauman 应用荧光素标记cRNA探针，在荧光显微镜观察成功。,4、1983年Brigat首建生物素标记的探针在组织切片上检出病毒DNA.,5、1987年Biochemisca 推出地高辛标记的试剂及药盒。,三、核酸探针的分类： 按标记方法分： 1、放射性探针：用放射性同位素32P、35S、3H标记，通过放射自显影方法显示。 特点：灵敏度高，辐射危害，耗时久，半衰期限制。,2、非放射性探针：用FITC, Biotin, DIG, HRP, AP 标记，用相应的检测系统显示。 特点：灵敏度也高，安全，快速，广泛应用。,按探针的性质分： 1、DNA探针： 双链：采用PCR方法，从基因库钓取或 人工合成。,单链：将DNA片段装载到质粒或菌体中，以此为模板用Taq酶合成互补单DNA探针或以RNA为模板，用反转录酶合成单链 cDNA探针。,特点：双链长度较长（数百数千个硷基），信号强， 但渗透性差。单链较好。,2、RNA探针：一般为单链；采用体外转录技术（单向或双向），用新型载体pSP和pGEM，在SP6 RNA或T7 RNA聚合酶作用下进行RNA转录而成。 特点：长度随意，稳定，信号更强。,3、寡核苷酸探针：已知基因序列，由核酸合成仪合成。 特点：链短，杂交速度快，特异性强，价廉质稳。,四、原位杂交技术的应用： 1、 基因芯片（基因组图）； 2、 基因表达定位； 3、 转基因检测。,4、核DNA和 RNA 的mRNA的排列和运输，复制和细胞分类 5、细胞遗传学、产前诊断、肿瘤诊断 6、病毒学和病原学、传染性疾病的诊断 7、生物学剂量的测定,五、原位杂交技术的基本方法： 包括： 1、杂交前准备：固定、取材、 玻片和组织处理，增强核酸探针的穿透性，减低背景染色等。 2、杂交： 3、杂交后处理： 4、显示：放射自显影，组化 或免疫组化显色。,（一）固定：DNA 较稳定，mRNA次之， RNA 最易被酶降解。,固定液： (1) 4%的多聚甲醛（加1/1000 DEPC） (2) 冰醋酸酒精 (3) Bouin 固定剂 (4) 冰冻切片直接在(1)液10min,（二）玻片处理：载玻片经热肥皂水刷洗-清洁液浸泡24h-95%酒精浸泡24 h-蒸馏水冲洗-1500C以上烘箱过夜。,玻片粘附剂：多聚赖氨酸，APES。 盖玻片应做硅化处理。,（三）防止RNA酶污染： 1、整个实验过程均需戴消毒手套。 2、实验用玻璃器皿在实验前一日置高 温 （2400C）烘烤，以破坏RNA酶。,（四）、增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： 1、Triton X-100 2、蛋白酶K（Proteinase K 1ug/ml） 37 0C 1520 min 3、胃蛋白酶（Pepsin 20100ug/ml） 37 0C 30 min 上述酶消化后用4%多聚甲醛后固定。,（五） 减低背景染色 1、乙酸酐和三乙醇胺浸洗，以减低静 电效应。 2、杂交后酶处理。 3、杂交后洗涤。,（六） 预杂交：用不含探针和硫酸葡聚糖的液体封闭非特异性杂交点。,杂交： 1、 滴加杂交液：轻加，不产生气泡，或用DAKO笔沿组织周围划圈。加硅化盖玻片（无菌蜡膜也可）。 2、盖玻片周围加液体石蜡或用橡皮泥封固，以防杂交液蒸发。 3、组织切片置于盛有2SSC溶液的湿盒中孵育。,（八）杂交后处理： 1、用含低浓度RNA酶（20ug/ml）液将切 片的非碱基配对的RNA除去。 2、盐溶液（SSC）浓度由高到低，温度 由低到高。 3、切片切忌干燥。,（ 九）显示（使用检测系统）： 1、放射自显影（略）。 2、酶检测系统（与免疫组化同）。,（十）对照实验：根据实际情况定。 1、将切片用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交。 2、吸收试验：用cDNA或cRNA探针进行预杂交。,1、置换试验：用与载体非特异的序列和 不相关探针杂交。 2、空白试验：用未标记探针或不加探针 的杂交液进行杂交。 3、用已知确定为阳性或阴性组织进行 杂交对照。,六、原位杂交实际操作举例：,DNA 与mRNA原位杂交步骤 1、 石蜡切片经常规脱蜡到水。 2、3%H2O2室温处理10分钟（以灭活内源 性过氧化物酶）蒸馏水洗。,3、暴露DNA/mRNA核酸片段： (1) DNA: 蛋白酶K（10ug/ml) 室温消化10分钟； （2）RNA:胃蛋白酶370C消化30分钟。 4、0.5M PBS洗3次5分钟，蒸馏水洗1次。,DNA杂交： 1、切片置于2SSC中，微波炉加热95 10010分钟；迅速插入冰水2分钟； 2、DNA探针于90 水中10分钟,迅速插入碎冰3分钟；,5、杂交：切片在空气干燥后，按每张切片加20l含地高辛标记的DNA/RNA探针原位杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，恒温箱37 400C过夜。,6、杂交后洗涤：揭掉盖玻片，30-370C 左右水温的2SSC洗涤5分钟3次。 7、滴加杂交探针稳定液37-400C 反应4-6小时（此步可省略）。 8、0.2SSC洗涤5分钟3次。,9、滴加封闭液：室温20分钟，不洗。 10、滴加兔抗地高辛：370C ，60分钟。 11、 0.5M PBS洗5分钟3次。 12、滴加生物素化羊抗兔IgG，370C， 30分钟。 13、0.5M PBS洗5分钟3次。,14、滴加S-P试剂: 370C，30分钟。 15、0.5M PBS 洗5分钟4次。 16、DAB显色：20-30分钟，充分水洗。 17、酒精脱水，二甲苯透明，封片。,七、 结果判断： 1、DNA原位杂交的阳性信号一般存在于细胞核内。 2、RNA原位杂交的阳性信号位于胞浆内。,生殖细胞瘤16号染色体 ISH,HER2荧光原位杂交,皮肤鳞状上皮细胞核HPV DNA（+） ISH,宫颈粘膜 上皮HPV16（+） ISH,宫颈粘膜上皮HPV16（+） ISH,宫颈鳞癌HPV18(+)，ISH,鼻咽癌 EBER(+), ISH,肾小管上皮细胞核HBVDNA（+），ISH,食管粘膜基底层细胞质 Egr-1 mRNA（+），ISH,食管鳞癌细胞质 Egr-1 mRNA（+）， ISH,食管鳞癌细胞质 CyclinD1mRNA（+）， ISH,胃腺癌细胞质端粒酶hTR(+), ISH,肝细胞癌 CD44V6 mRNA（+）， ISH,肝细胞癌 整合素 a5 mRNA（+）， ISH,乳腺癌细胞质PR mRNA(+), ISH,脑星形细胞瘤 血小板生长因子 mRNA（+）， ISH,3、 阳性信号的评定（半定量）： （1）阳性细胞数：阳性细胞 10% 、 30%、 70%和70%分别为 1、 2、 3、4分。 （2）阳性着色强度：按弱、中、强三 级分别为 1、2、3分。,4、 用计算机辅助的图像分析、显微分光度计或图像分析仪对不同类型核酸显色数量和强度进行检测。,七、原位杂交结合免疫组织化学双标记法： 原位分子杂交检测DNA或RNA，能进行基因定位或在转录水平上研究基因表达； 免疫组织化学检测细胞和组织内蛋白抗原 成分，在翻译水平上研究基因表达。二者 结合起来，形成一个新的分子检测系统， 对于深入研究基因扩增、表达的调控与疾 病的发生机理有广泛的应用前景。,注意事项： 1、先做原位杂交（因mRNA易被降 解），后做免疫组化。 2、做原位杂交时应适当减低漂洗温度， 以减少生物活性肽或蛋白的丢失。,3、原位杂交完成后不显色，在加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体时混入免疫组化的第一抗体。 4、用上述方法必须是双酶双标，即分别用硷性磷酸酶和辣根过氧化物酶。,5、用不同的显色液，一般先用DAB, 后用 CIP/NBT显色，分别显成棕黄色和紫蓝色。 6、阳性细胞可为棕或蓝单色或为蓝棕混合色。,肾小管细胞核HBVDNA，细胞质 HBsAg 双（+），ISH-IHC,肝细胞HBVDNA ，HBsAg 双（+）， ISH-IHC,原位杂交是一个很复杂的操作过程，许多条件不好掌握。尤其对初作此项工作的人往往面对失败而束手无策；但目前国际、国内许多公司已推出一系列成套的原位杂交检测试剂盒，可方便使用。,试剂盒内包括：蛋白酶K，含标记探针的杂交液，封闭液及检测系统等主要试剂；由于每种试剂都经过最优化检测后配制， 所以成功率高，操作也简便，使原位杂交在一般实验室进行成为可能。,The End,细胞凋亡检测技术,一 、前言：凋亡（Apoptosis） 程序性细胞死亡 （programmed cell death, PCD） 细胞自身的一种主动的生理性死亡过程，一种不同于坏死的死亡方式；是由基因控制的细胞自我消亡过程。,光学显微镜HE染色观察凋亡细胞： 核染色质浓缩、碎片形成（为时已晚）。 原位末端标记凋亡细胞：可有或无上述特征（早期观察）。,*细胞凋亡时内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3OH末端；利用末端脱氧核糖核酸转移酶将地高辛标记的dUTP结合在3OH末端，再通过酶联反应，最后用显色剂予以显色。,二、凋亡检测技术： 1、原位细胞凋亡； 2、凝胶电泳； 3、流式细胞术； 4、激光扫描。,三、凋亡细胞的形态学： 普通光学显微镜下形态：,1、组织处理：一般无特殊。 （1）培养细胞应低速离心（250r/min）5分钟，避免破碎。 （2）防脱片：1%牛血清白蛋白、卵蛋白、处理玻片。,2、染色方法： （1）普通HE染色； （2）Giemsa 染色； （3）Mayer苏木素。,3、细胞形态： （1）凋亡细胞：体积缩小，胞浆浓缩、 红染，核固缩深染或碎裂。 （2）凋亡小体（嗜酸性小体）：被巨噬细 胞或上皮细胞吞噬或游离的凋亡细胞。圆形 或卵圆形、大小不等，胞浆浓缩，强嗜酸性， 可有或无固缩深染的核碎片。,食管鳞癌细胞系TUNEL染色,食管鳞癌细胞系石蜡切片HE染色,（二）荧光显微镜下形态：荧光显微镜下凋亡细胞呈黄色。 1、 荧光染料： PI(propidium iodide) 510ug/ml DAPI（4，6diamidino-2-phenylindole） 12/ug/ml 7-AAD(7-aminoactinomycin D) 1020/ ug/ml,Hoechst 33342（12.3mg + 双蒸10ml） /PI 双染色。 2、染色时间：半小时1小时。 *PI染色因PI同时与RNA结合，应先用RNA酶消化（3715分钟）,白血病细胞 HL-60 APO-BRDU,鼻咽癌细胞Hoechst33342/PI双染荧光显微镜 400,（三）凋亡细胞的电镜观察： 1、组织处理：组织、细胞固定、包埋、 染色与一般电镜标本相同。,（1）透射电镜：与光镜基本相同，仅是放大倍数不同而已，表现如下：, 凋亡的细胞皱缩，胞膜完整, 胞浆致密，细胞器密集可有不同程度的退变（线粒体肿胀等）。, 核：染色质致密，凝集成块状，边集于核膜处胞核裂解。, 胞质多发性芽突，芽突脱落凋亡小体（胞膜包绕，其中含有不同程度退变的细胞器和脂滴、核碎片可有可无）。,（2）扫描电镜：细胞呈波浪状或细胞表面结构改变，如伪足，微绒毛消失等。,（四）凋亡细胞的原位末端转移酶标记：（TdT-mediated dUTP nick end labeling ， TUNEL method）,原理：细胞凋亡细胞内源性核酸内切 酶被激活核染色质DNA双链断裂露 出3-OH末端DNA片段 TDT酶与生物素 或地高辛标记的核苷酸结合荧光素/酶链 标记卵白素/抗地高辛抗体结合凋亡细胞 原位显示。（检测凋亡细胞的特异性手段）。,1、组织处理： （1）新鲜标本：人体组织离体后迅速固定，动物实验可用内灌注后处死。 （2）固定液：10%中性福尔马林、4%多聚甲醛、80%乙醇。,（3）固定时间： 活组织不超过24小时，最好在4小时以内。 冰冻切片4%多聚甲醛4固定30分钟或80%乙醇固定2小时,（4）保存：石蜡块 20保存，时间不超过半年。冰冻切片20保存，时间不超过一月。,2标记步骤：,试剂盒内容： 标记缓冲液（Labeling Buffer）1ml 蛋白酶K(Proteinase K)100ul 末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT,20）20ul DIG-dUTP(20) 20ul 封闭液（Blocking Reagent）2ml 生物素化抗地高辛抗体（100）20ul /碱性磷酸酶抗地高辛抗体 S-P试剂（100）20ul 自备：显色液：DAB或BCIP/NBT。,Tunel法实验操作步骤 1、二甲苯脱蜡，10分钟3次； 2、 经梯度酒