原核基因表达调控-研.ppt

第六章 基因的表达与调控(上) 原核基因表达调控模式,Contents,基因表达调控的基本概念 原核基因调控机制 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 其他操纵子 转录后水平上的调控,第一节 基因表达调控的基本概念,一、基因表达的概念 随着生物个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统转变成蛋白质，执行各种生理生化功能。 科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达（gene expression） 对这个过程的调节就称为基因表达调控（gene regulation或gene control）,rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达,组成性表达(constitutive expression) 适应性表达(adaptive expression）,二、基因表达的方式,1、组成性表达：,指不大受环境变动而变化的一类基因表达。,某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。,2、适应性表达 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene)； 相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为可阻遏的基因(repressible gene)。,三、基因表达的规律 时间性和空间性,1、时间特异性（temporal specificity）,2、空间特异性(spatial specificity),基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。,在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性。,四、基因表达调控的生物学意义,适应环境、维持生长和增殖（原核、真核） 维持个体发育与分化（真核）,第二节 原核基因调控机制,内容提要： 原核基因表达调控环节 操纵子学说 原核基因调控机制的类型与特点 转录水平上调控的其他形式,一、基因表达调控环节,1、转录水平上的调控 （transcriptional regulation） 2、转录后水平上的调控 （post-transcriptional regulation） mRNA加工成熟水平上的调控 翻译水平上的调控 蛋白质加工水平的调控,二、操纵子学说 1、操纵子模型的提出 1961年，Monod和Jacob提出 获1965年诺贝尔生理学和医学奖,Jacob and Monod,2、操纵子的定义,操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。,1、根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的应答，可分为： 正转录调控 负转录调控,三、原核基因调控机制的类型与特点,激活蛋白,正转录调控,负转录调控,正转录调控,如果在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控叫正转录调控。,激活蛋白,正转录调控,负转录调控,负转录调控,在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控负转录调控。,可诱导调节：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。 例：大肠杆菌的乳糖操纵子 分解代谢蛋白的基因,2、根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类：,酶合成的诱导操纵子模型,诱导物,如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物。,可阻遏调节：基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。 例：色氨酸操纵子 合成代谢蛋白的基因,酶合成的阻遏操纵子模型,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,辅阻遏物,如果某种物质能够阻止细菌产生合成这种物质的酶，这种物质就是辅阻遏物。,3、在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用。 根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏： 在负控诱导系统中，阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录； 在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。,4、在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。 根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导和正控阻遏 在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状； 在正控阻遏系统中，效应物分子（辅阻遏物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。,正控诱导,正控阻遏,四、转录水平上调控的其他形式,1、因子的更换 在E.coli中,当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合。,大肠杆菌中的各种因子比较,温度较高,诱导产生各种热休克蛋白 由32参与构成的RNA聚合酶与热休克应答基因启动子结合,诱导产生大量的热休克蛋白,适应环境需要,枯草芽孢杆菌芽孢形成 有序的因子的替换,RNA聚合酶识别不同基因的启动子,使芽孢形成有关的基因有序地表达,2. 降解物对基因活性的调节,有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，因而也不会产生出代谢这些糖的酶，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。 为什么会产生这种效应呢？ 因为葡萄糖是最方便的能源，细菌无需开启一些不常用的基因去利用其他糖类。添加葡萄糖后，葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶活性，减少环腺苷酸（cAMP）的合成，与它相结合的蛋白质，即环腺苷酸受体蛋白CRP又称分解代谢物激活蛋白CAP，因找不到配体而不能形成复合物。而cAMP- CAP复合物的形成又是乳糖、半乳糖或阿拉伯糖操纵子等表达所必须的。,3. 弱化子对基因活性的影响 属于这种调节方式的有大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸操纵子等等。 起信号作用的是有特殊负载的氨基酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰-tRNA的浓度。 当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段核苷酸被称为弱化子。这种因为核糖体在基因转录产物上的不同位置，决定了RNA可以形成哪一种形式的二级结构、并由此决定基因能否继续转录的调节方式确实是非常巧妙的。 起调节作用的信号分子是细胞中某一氨基酸或嘧啶的浓度，因此是转录调节中的微调整，好比无线电调谐器中的微调一样，只要稍加变动就可影响整个体系的功能。,4.细菌的应急反应,细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少一两种氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止。实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp）。产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。 当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。ppGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况。 关于ppGpp的作用原理还不大清。ppGpp与pppGpp的作用范围十分广泛，它们不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以它们是超级调控因子。,小结,一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。 这种“开-关”（on-off）活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。,第三节 乳糖操纵子(lac operon),内容提要： 乳糖操纵子的结构 酶的诱导lac体系受调控的证据 乳糖操纵子调控模型 影响因子 Lac操纵子中的其他问题,一、乳糖操纵子的结构,Z编码-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖 Y编码-半乳糖苷透过酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,二、酶的诱导lac体系受调控的证据,在不含乳糖的培养基中，每个大肠杆功细胞内大约只有1-2个利用乳糖的酶分子。如果在培养基中加入乳糖，利用乳糖的酶浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。 由底物导致合成利用该底物的酶，这种现象称为酶的诱导。,如何确定诱导物的作用是诱导新酶合成，还是将已存在于细胞中的酶前体转化为有活性的酶？,把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸 但没有半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代 然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中 随着培养基中诱导物的加入，-半乳糖苷酶便开始合成 分离-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记 说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的,同位素示踪实验,酶的诱导现象是生物进化过程中出现的一种合理、经济地利用有限资源的本能。 酶诱导已证明是低等生物的普遍现象。,Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，可以用实验方法进行研究，因此选为突破口，终于通过大量实验及分析，于1961年建立了该操纵子的控制模型。,机制：阻遏蛋白的负性调节,无乳糖: lac操纵子处于阻遏状态(repression) 有乳糖: lac操纵子即可被诱导 诱导剂(inducer): 别乳糖、半乳糖、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）,安慰诱导物： 如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物，如IPTG（异丙基- D-硫代半乳糖苷）。,三、乳糖操纵子调控模型,主要内容： Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码, 这个mRNA分子的启动子（P）紧接着操纵基因（O），而位于调节基因（I）与O之间的启动子P，不能单独启动合成-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。, 操纵基因（O）是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。,RNA聚合酶结合部位,阻遏物结合部位,操纵位点的回文序列,当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。,诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成。 当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。,组成型突变： lacOc,几种突变对Lac操纵子的影响,组成型突变： lacI-,几种突变对Lac操纵子的影响,不可诱导突变（超阻遏）：,几种突变对Lac操纵子的影响,四、影响因子,1、lac操纵子的本底水平表达 有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的： 诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成又需要诱导。 真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有-半乳糖苷酶的预先存在。,解释： 一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？ 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？ 一些诱导物可以在-半乳糖苷酶不存在时被分解成半乳糖？ 一些-半乳糖苷酶在没有诱导物的情况下合成？,本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。,2、大肠杆菌对乳糖的反应,培养基：甘油 按照lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的-半乳糖苷酶和-半乳糖苷透过酶； 培养基：加入乳糖 少量乳糖,透过酶,进入细胞,-半乳糖苷酶,异构乳糖,诱导物,诱导lac mRNA的生物合成,大量乳糖进入细胞,多数被降解为葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）,异构乳糖,乳糖,诱导物的加入和去除对lac mRNA的影响,3、阻遏物lacI基因产物及功能,Lac 操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有5-10个阻遏物分子。 当I基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导。,4、葡萄糖对lac操纵子的影响,如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中， lac操纵子处于阻遏状态，不能被诱导；一旦耗尽外源葡萄糖，乳糖就会诱导lac操纵子表达分解乳糖所需的三种酶。 代谢物阻遏效应：葡萄糖对lac操纵子表达的抑制是间接的，不是葡萄糖本身而是其降解产物抑制lac mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称为代谢物阻遏效应。,5、cAMP与代谢物激活蛋白,代谢物激活蛋白（CAP）/环腺甘酸受体蛋白（CRP） CRP+cAMP 复合物CAP,ATP,腺苷酸环化酶,cAMP（环腺苷酸）,大肠杆菌中：无葡萄糖，cAMP浓度高； 有葡萄糖，cAMP浓度低,无葡萄糖，cAMP浓度高时 促进转录,有葡萄糖，cAMP浓度低时 不促进转录,CAP的正调控,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用,如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。 cAMPCAP复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。,协调调节,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。,第四节 色氨酸操纵子（trp operon）,内容提要： 色氨酸操纵子的结构 色氨酸操纵子的阻遏系统 色氨酸操纵子的弱化机制,一、色氨酸操纵子的结构 调控基因 结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸 的酶,trpR,trp,特点: (1) trpR和trpABCDE不连锁； (2) 操纵基因在启动子内 (3) 有衰减子(attenuator)/弱化子 (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列(Leader)所隔开,二、trp 操纵子的阻遏系统,低Trp时： 阻遏物不结合操纵基因; 高Trp时： 阻遏物+Trp 结合操纵基因,三、trp 操纵子的弱化机制,衰减子（attenuator）/弱化子 前导序列（leader sequence）,1、弱化子： DNA中可导致转录过早终止的一段核苷酸序列（123-150区）。,123150,研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。,2、前导序列：在trp mRNA5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。,3、弱化机制,前导肽,转录终止结构,细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只