生化chapter0307aminoacidsa.ppt

How can we study protein?,第三章 氨基酸与蛋白质,概念 分类 功能,第四章 蛋白质性质及研究技术,1、酸碱性质,2、胶体性质,4、分离纯化技术,蛋白质 性质,1.蛋白质的酸碱性质,C,O,O,Pr,H,3,N,+,C,O,O,Pr,H,2,N,pH pI,pH = pI,pH pI,由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所具有的两性游离性质，蛋白质也同样具有。,当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正离子和负离子的趋势相等，为兼性离子，即总净电荷为零，此时在电场中，蛋白质分子既不向阳极移动，也不向阴极移动，这个pH值称为蛋白质的等电点，用pI来表示。,1. 蛋白质的酸碱性质,2.1 蛋白质的胶体性质,分散相质点小于1 nm时称为真溶液，分散相质点大于100 nm时称为悬浊液，而分散相质点在1100 nm之间时称为胶体溶液。 蛋白质在水溶液中的颗粒约为1100 nm，所以蛋白质溶液属于胶体系统，是一种亲水胶体，蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。 蛋白质溶液也具有布朗运动、丁达尔效应以及不能透过半透膜等性质。,形成水化层 形成双电层,为什么蛋白质具有胶体性质,2.2 蛋白质的沉淀反应,1盐析和盐溶法 2有机溶剂沉淀法 3重金属盐沉淀法 4生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 5加热凝固,盐溶：少量的中性盐，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。 原理：蛋白质吸附某种盐离子双电层蛋白质彼此排斥。蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，因而溶解度提高。 盐析：向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层，同时中和了蛋白质的电荷，降低了蛋白质的溶解度，从而使蛋白质沉淀。 常用：以硫酸铵（中性盐）最常应用。因其溶解度大，且不易伤害蛋白质，另外还有硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等。,2.2.1 盐析和盐溶法,2.2.1 盐析和盐溶法,等电点时，无电荷间的相互作用，聚合沉淀；加入少量盐离子后破坏了这种作用，使分子分散，溶于水中,蛋白质分子表面聚集了许多水分子，当盐浓度高时，水分子被盐抽出，蛋白质的疏水区域暴露并相互结合，沉淀。,2.2.1 盐析和盐溶法,2.2.2 有机溶剂沉淀法,可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。如酒精的消毒作用。 在低温条件下，变性进行较缓慢，可以用来制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样存在有大量盐类，必须经透析除去，而且有机溶剂很易通过稀释透析及蒸发等方法除去。,2.2.3 重金属盐沉淀法,pH稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质带负电，易与金属离子结合成盐。 通常这种沉淀为变性的，如控制温度（低温）并控制重金属离子浓度，则可用于分离制备不变性的蛋白质。,2.2.4 生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质,某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。 沉淀条件应当是pH小于等于电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。,2.2.5 加热凝固,将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热可使蛋白质发生凝固而沉下。 鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都变成固体样的东西了。,3. 蛋白质分子量大小及测定方法,1化学组成法 2渗透压法 3扩散平衡法 4沉降系数法 5凝胶过滤法 6. SDS凝胶电泳法,台式高、超速离心机 0.6-10万rpm,离心机,制备性,分析性,分析性超速离心机,普通离心机,冰冻离心机,台式（或地面式）普通离心机,大容量冰冻离心机 小于0.6万rpm,高速冰冻离心机 0.6-2.5万,超速冰冻离心机 2.5-8万或更高,(分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等),差 速 离 心,密度梯度（区带）离心,密度梯度（区带）离心,凝胶过滤法测相对分子量,洗脱液体积（mL）,蛋白质含量,相对分子量 Mr,A,B,C,D,待测蛋白分子量,SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳法测相对分子量,SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳法测相对分子量,A,B,Rf=A/B,4.1 蛋白质分离纯化的依据,1分子大小 2溶解度 3电荷 4吸附性质 5特异的生物亲和力,4.2 根据蛋白质分子大小建立的分离纯化方法,凝胶过滤（分子排阻层析）,基于分子大小,常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶,分级沉淀（盐或有机溶剂）,4.3 根据蛋白质溶解度大小建立的分离纯化方法,工艺流程说明： 1.发酵液预处理 2.压滤 3.浓缩 4.沉淀 5.压滤 6.干燥,4.4 根据蛋白质电荷差异建立的分离纯化方法,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,平板电泳,等电聚焦电泳,4.5 根据蛋白质吸附特性建立的分离纯化方法,4.6 根据蛋白质特异亲和 力建立的分离纯化方法,凯氏定氮法 紫外吸收法 双缩脲法 Folin-酚法（Lowry法，蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。 ） Bradford法（考马斯亮蓝染料结合法） BCA法（bisinchoninic acid method）,4.7 蛋白质含量测定的常用方法,4.7.1凯氏定氮法,原理：氮在蛋白质分子中含量恒定（平均占16%），因此测出样品中氮的含量后，即可求得样品中蛋白质含量。 每克样品中含氮的克数6.25100=100克样品中蛋白质的含量（克%）。 将蛋白质样品用浓H2SO4 消化分解（加热、常加少量的硫酸铜、硫酸钾作催化剂），使其中的氮转变为铵盐，碳转变为CO2，硫转变为SO2、SO3等逸出。铵盐再与浓碱反应，放出的氨被酸（硼酸）吸收，滴定剩余的酸，算出氮的含量。,4.7.2 紫外-分光光度计法,由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，但各种蛋白质中的这两种氨基酸含量差别不大，所以在280nm吸收值与浓度成正比，可用于蛋白质含量测定 此法准确度较差，因为有诸多因素的干扰（如核酸），通常用280nm及260nm下的吸收差大概计算蛋白质的浓度 蛋白质浓度mg/ml=1.45A2800.74 A260 由于此法非常简便，条件要求低，因此常作为粗略定量蛋白质的方法来使用 。,4.7.3 双缩脲法（Biuret法）,包含肽键基团的化合物能与硫酸铜-氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物。 在540 nm处测定其吸光值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。 双缩脲法的测定范围为110 mg蛋白质。 优点是快速，缺点是灵敏度差。,4.7.4 Folin-酚试剂法（Lowry法）,其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生双缩脲反应，然后蛋白质中的酚基（如酪氨酸）在碱性条件下很容易将混合试剂（含有磷钼酸和磷钨酸）还原或蓝色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在650660nm下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。 此法比双缩脲法灵敏100倍。蛋白质测量范围在25250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受还原剂、EDTA、Tritonx-100及酚的影响，并且蛋白质的种类不同，有较大的变动。,4.7.5 考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法）,用考马思亮兰G-250染色蛋白质，出现的颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。其颜色在595nm的光波下，有强烈吸收峰。 常用此反应来定量测定蛋白质含量。,4.7.6BCA法,BCA法是对一价铜离子敏感、稳定和高特异性活性的试剂。 在碱性溶液中，蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子，一价铜离子与测定试剂中的BCA形成一个在562 nm处具有最大光吸收的紫色复合物，该复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。,电泳 （等电聚焦、SDS-PAGE、PAGE） 沉降法 HPLC 溶解度分析 N末端分析,4.8 蛋白质纯度测定的常用方法,5.1 蛋白质组学的基本概念,蛋白质组学是研究与基因组相对应的蛋白质组的学科。 它与蛋白质化学截然不同。蛋白质组学将组织或者细胞中的蛋白质作为一个系统来研究，而蛋白质化学则只研究蛋白质的单一组分。 蛋白质组学的内容是系统生物学，重点研究作为一个大系统或部分网络的组成的多个蛋白质的相互作用。 蛋白质组学的研究目标可分为两个层次。一个层次是研究产生特定蛋白质的原因，以找到应对的策略，人为地控制蛋白质的表达，称为表达蛋白质组；另一层次是阐明已得到蛋白质的功能，称为功能蛋白质组 。 双向电泳技术、计算机图像分析、大规模数据处理技术、质谱技术被称为蛋白质研究的四大支撑技术。,蛋白质组学研究基本过程是：从细胞、体液或组织中提取蛋白质，经双向电泳技术分离得到蛋白质的表达图谱；采用计算机图像分析技术对图谱上的蛋白质点进行定位、定量、图谱比较、差异点寻找；然后采取两种方法进行蛋白质的鉴定，一是采用蛋白质转膜法进行氨基酸组成和序列分析，再进行数据库搜索比较；二是利用质谱技术进行蛋白质鉴定；最后需要利用生物学或者生物化学方法进行功能的研究和验证。,5.2 蛋白质组学的研究方法,蛋白质组学研究的技术路线,5.2 蛋白质组学的研究方法,5.2.1 完整蛋白质分离的方法凝胶电泳技术,常用于完整蛋白质分离的方法有三种：一维凝胶电泳（1D-SDS-PAGE）、双向凝胶电泳（2D-SDS-PAGE）和等电聚焦（IEF）电泳，2D-SDS-PAGE是蛋白质组学中常用的电泳技术。,2D-SDS-PAGE的分离图谱,5.2.1 完整蛋白质分离的方法凝胶电泳技术,质谱分析法是通过测定样品中离子的荷质比（m/z）来进行成分和结构分析的方法。 生物质谱技术在蛋白质鉴定中起着非常重要的作用。 用于蛋白质组学研究的质谱仪有两种类型：MALDI-TOF（基质辅助激光解吸离子化-飞行时间）和ESI（电喷雾离子化）串联MS（质谱）仪器。,通过MALDI-TOF质谱仪可以获得肽质量指纹图谱（PMF）。肽质量指纹图谱是指将蛋白质经专一酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱（PMF），是目前蛋白质组学研究中常用的鉴定蛋白质的方法。 其基本原理是根据不同蛋白质具有不同的氨基酸序列，经专一酶切位点的蛋白酶水解后会产生序列及大小均不相同的肽片段，这些肽混合物的质量数也具有不同的特征，因此产生肽片段质量图谱，称为指纹图谱。 通过数据库中指纹图谱的相似性比较可以进行蛋白质的鉴定，也可以通过这种方法确定2D-SDS-PAGE图谱上的新蛋白。 用ESI串联MS分析仪获得的数据则可以弥补一些肽质量