紫外-可见分光光度法.ppt

1,2,第3章 紫外可见分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry; UV-vis ）,概念：研究物质在紫外-可见光区分子吸收光谱的分析方法。（近紫外光区 200-400nm，可见光区400-760nm）,A,3,分光：将复合光变成单色光叫分光,可见光（400-760nm）,红橙黄绿青蓝紫,红外,紫外,610-780,400-435,分光系统,4,特点：灵敏度高（10-6g/ml），简单方便。,应用：1、定性分析 2、定量分析,发展趋势：与计算机联用及某些数学联用（如导数光谱）,5,1 基本概念,电子跃迁：,-*、-*、n-*、n-*,（1）跃迁类型,*,*,n,-*,-*,n-*,n-*,成键,成键,未成键,反键,反键,能量,6,（2）吸收强度（） ：I0与I相差越大， 吸收越强。,E,I0,I,同型轨道跃迁几率大，吸收强；不同型轨道跃迁几率小，吸收弱。 如-*吸收强， n-*吸收弱。,当104，为强吸收； 103为弱吸收； =103-104为中吸收,7,注意：吸收何种光（ ）与能级差有关（E） 吸收强度如何（）与跃迁机率有关。,E,I0,I,8,(1) -* 跃迁：能级大，E大，max小， -*的 max 150nm，远紫外吸收。,（2） -*跃迁： E 小 a 单个键， max =200nm，末端吸收 b 共轭键， max =210-250nm，104。,200nm,A,末端吸收,9,（3） n-*跃迁，存在于-C=O，-CN， E更小， max 250nm， =10-100。,(4) n-*跃迁，存在于-OH、-NH2、X等。 max =200nm，末端吸收。,10,A,A表示物质对不同光的吸收程度,300,400,500,600,(二) 术语,吸收曲线(吸收光谱): 以波长（nm）为横坐标，以吸光度A为纵坐标所描绘的曲线。,11,吸收峰：曲线上吸收最大的地方，它所对应的波长称最大吸收波长（max）。,谷：峰与峰之间的部位叫谷，该处的波长称最小吸收波长（ min）。,末端吸收：在图谱短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分称末端吸收。,A,吸收峰,肩峰（sh）,吸收谷,末端吸收,max,min,12,生（发）色团：可引起电子跃迁的不饱和基团。主要为-*、n-*跃迁，如CC、CO等。,助色团：与发色团相连的饱和的杂原子或原子团。如OH、NH2、OR、SH、SR、卤素原子等。,13,红移（长移）：使吸收峰向长波方向移动。如助色团、共轭键的影响。,蓝（紫）移（短移）：使吸收峰（）向短波方向移动。如共轭键减少或溶剂的影响。,增色效应和减色效应：使吸收强度（）增加称增色效应。反之称减色效应或淡色效应。,强带和弱带：化合物的紫外可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数值（max）大于104的吸收峰称为强带，凡max小于103的吸收峰称为弱带。,14,（三）吸收带及其与分子结构的关系,吸收带:说明吸收峰在紫外可见光谱中的位置。可分为六种类型。,R带：由n-*跃迁引起的吸收带。如CO NO等,特点 ：（1）max250nm,（2） 100，为弱吸收,（3） 溶剂的极性越大， max减小,200nm,250nm,15,例,非极性溶剂,极性溶剂,*,n,*,n,16,K带：由共轭双键中-*跃迁所产生的吸收峰。 如 等。,特点 ：（1）max=210-250nm,（2） 104，为强吸收,（3） 溶剂的极性越大， max越大,200nm,250nm,17,-*跃迁，K带,*,*,非极性溶剂,极性溶剂,18,-*跃迁，K带 n-*跃迁，R带,，,，,200nm,300nm,A,K带,R带,19,B带：苯环骨架振动和环内共轭-*重叠所致，是芳香族化合物的特征吸收带。,特点: (1)在非极性的溶剂中，B带230-270nm产生细微振动,20,（2）在极性的溶剂中，细微结构消失，中心吸收带max=256nm附近，在200左右。,（3）被取代时，细微结构消失,（4）B带是有机化合物的特征谱带,蒸气,在环已烷中,在水中,240nm,260nm,256nm,21,E带：由苯环结构中三个乙烯的-*所产生，分为E1和E2带。是苯环的特征吸收谱带。,E1带：180nm，4.7104。,E2带：=200nm 7000。,22,例：,B带 max 增大，282nm,E2带与K带合并，移至210-250nm,B R K,当苯环上有发色团取代并共轭时，E2带与K带合并，吸收带长移，且使B带长移。,23,log,10,300,200,100,500,400,700,600,800,1,2,3,4,5,远紫外区,近紫外区,可见光区,*,*,*,n,n,波长(nm),几种常见的紫外与可见吸收光谱,*,n,R带,K带,R带,*,K带,24,运用：预测一个化合物的吸收带可能出现的范围及吸收带的类型。,R带（250-500nm）,*,n,共轭 K带（210-250nm）,*,25,(四)影响吸收带的因素,1.位阻影响 立体空间结构影响共轭效应。,顺式二苯乙烯,反式二苯乙烯,同分异构体：,26,2.跨环效应,3.溶剂效应：除了影响吸收峰（）位置外，还影响吸收强度（）和光谱形状。,溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响,跃迁类型 正已烷 氯仿 甲醇 水 迁移,-* 230 238 237 243 长移,n-* 329 315 309 305 短移,27,4.体系pH值的影响：主要是对弱酸弱碱性物质的影响。,非极性溶剂,极性溶剂,非极性溶剂,极性溶剂,跃迁,*,n,跃迁,*,28,2 基本原理吸光的定量关系,一.参数,1.入射光的强度I0,I0,b,2.透射光的强度I,I,3.透光率 TI/I0 百分透光率TI/I0 100,4.比色池厚度：b,5.样品浓度：C（mol/l，）,6.吸光度：AlogT=lg(I0/I),I0、I、C、b、T、A量的关系,29,二.Lambert-Beer定律,Lambert定律：C一定，A-logT=K1b,Beer定律：b一定，A-logT=K2c,两定律合并：Aabc a=K1K2 a为吸收系数,注：吸光度A是指某一波长（）下的吸光强度即入射光为单色光,30,吸收系数：,摩尔吸收系数()：在一定条件下，当C1mol/l，b=1cm时的吸光度。,百分吸收系数（E 1cm 1% ）：一定条件下，当C1，b=1cm时的吸光度。,31,特征：1）、E均为特征常数 2）、E是有条件的，同一物质，不同条件下所测值不同（波长不同、溶剂不同、温度不同等）。 3）、E越大，测定吸光度灵敏度越高。 4）=104-105为强吸收，103-104为中吸收，103为弱吸收。 5） 用于定性判断，K带吸收大，、E 大，R带的、E小。,32,例：紫草素（C16H6O5 288.3），2.00mg溶于100.0mlEtOH中，b=1cm，max =516nm，A=0.484.求、E,注：若溶液中存在多种吸光物质时，吸光度将是各组分吸光度的总和。,A总Aa+Ab+Ac+ adCa+ bdCb+ cdCc+,I0,a、b、c,I,d,注：每种物质的吸收度仅由本身的性质和C决定，与其它物质无关。,33,吸光度A具有加和性，对同一物质来说,工作曲线,C,A,负偏离,正偏离,线性范围：线性范围越大越好。,C1,34,三、偏离Beer定律的因素,1)化学因素：离解、缔合、配位等化学变化，使吸光物质形态发生变化。溶剂、pH、温度等影响。,Aabc,影响吸收系数a的因素有：,1、物质的性质,2、波长的不同,3、其它因素 如溶剂的影响等,35, 104,亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱,a,b,c,(a)6.3610-6mol/l,(b)6.3610-4mol/l,(c)6.3610-3mol/l,C,A,负偏离,610nm,660nm,36,2、光学因素,（1）单色光的纯度,2 1,A,A,Beer定律前题：入射光是单色光。,37,单色光,I0,I,单色器,复合光,狭缝,I0,比色池,760nm,400nm,可见光,I,I/2,谱带宽度: 狭缝具有一定宽度，使分离出的光同时包含了所需波长的光和附近波长的光。常用半峰宽来表示。,单色光的谱带宽s=2-1,1 2,510-520,透光强度,38,谱带宽度的值愈小，单色性愈好。但因仍是复合光，故仍可以使吸光度变小而偏离Beer定律。,39,（2）杂散光:与所需波长相隔较远的光。,Io,Is,I,Is,40,（4）非平行光,（3）散射、反射,克服方法：,比色池：擦干净 溶液：溶液均一，透明；用空白作参比。,克服方法：比色池位置放正确，与光路垂直。,41,3.透光率测量误差：T （是偶然误差，来自噪声）,读数精度,42,透光率T% 吸光度A C/C100%,0.022 10.2 80 0.097 2.8 70 0.155 2.0 0.022 1.63 0.399 1.36 0.523 1.38 20 0.699 1.55 10 1.000 2.17,不同T%或A时的浓度相对误差（ T= 0.5%）,43,结论：当A值在0.2-0.7，相对误差较小，是测量最适宜范围。,C/C,A,0.2 0.7,A=0.434 T%=36.8%,44,3 显色反应及其显色条件的选择,一、有色物质的测定,二、显色后物质的测定,45,1、显色剂与显色反应,显色反应：在光度分析中将被测组分转变为有色化合物的反应。,显色剂：与被测组分反应生成有色化合物的试剂，称为显色剂。,二、显色后物质的测定,46,1、灵敏度高 从来判断 2、选择性好 3、稳定性好 显色反应生成有色化合物组 成稳定。 4、显色剂在测定波长处无明显吸收 一般要求两者最大吸收波长相差60nm 5、反应具化学计量关系,显色反应的选择原则,47,1）显色剂的选择：生成物稳定，且有一定的计量关系。,2）溶剂：根据反应物、生成物的溶解度确定。,2、显色条件的选择,48,3）显色剂的用量：应加入略过量的显色剂。,a,b,a,b,A,A,C,C,49,4）酸度 溶液酸度的影响是多方面的。,（1）对显色剂颜色的影响 （2）对显色反应影响,5） 显色时间：,a,b,A,t,注：确定实验方法要考察稳定性。,6） 显色温度：显色反应进行与温度有关。,50,3、反应条件的控制,确定反应条件，需通过实验考察，已确定 的实验条件，不应随意更改条件。,51,4 测量条件的选择,1、测定波长的选择： 选择原则“吸收最大，干扰最小”。如出现几个最大吸收波长时，选择干扰最小，吸光度较大而且平坦的最大吸收波长。,2、控制吸光度测量范围,吸光度控制在0.2-0.7。,方法：调节溶液的浓度 改变吸收池的厚度,52,3、选择适宜的空白（参比）溶液 种类：（1）溶剂空白：溶剂作为空白。,适用：溶液中只有被测组分对光有吸收，其它组分对光无吸收。,（2）试剂空白：与样品相同条件下，不加试样溶液，其余均加。,适用：测定条件下，显色剂或其它试剂、溶剂对待测组分测定有干扰的情况。,53,（3）试样空白：如为显色反应，只是不加显色剂所制备的溶液。,适用：试样基体有色并在测定条件下有吸收。,54,药物中微量铁的测定,在2只25ml容量瓶中,用吸量管分别加入0.00,1.00ml铁标准溶液,分别加入1ml盐酸羟胺,2ml邻二氮菲,5ml醋酸-醋酸钠缓冲液,用水稀释至刻度后摇匀,主置10min.用1cm比色皿,以试剂为空白,在所选波长下,测量吸光度。,55,单色光,I0,I,单色器,复合光,狭缝,I0,比色池,检测器,记录,5 紫外-可见分光光度计,56,一、组成：光源单色器吸收池检测器记录,钨灯、氘灯,狭缝、色散元件、 准直镜,比色池、比色皿,光电池、光电管、光电二极管阵列,指针显示、数字显示,57,光源 要求：发射强度足够且稳定 具有连续光谱,钨灯和钨卤灯：发射光能的波长覆盖宽，但紫外区很弱。常取波长大于350nm的光为可见区光源。寿命达10000小时。,氢灯和氘灯：发射波长为150-400nm的连续光谱。使用时间1000小时。,58,单色器 将光源的连续光谱变成单色光。,组成：进口狭缝、准直镜、色散元件、出口狭缝,进口狭缝,出口狭缝,色散元件,准直镜,混合光,单色光,59,1）色散元件：棱镜和光栅,棱镜:对不同波长的光有不同的折射率。,缺点：色散后光谱按波长排列疏密不均，长波区密，短波区疏。为非均匀分布光谱。,分光系统,红 紫,60,光栅:利用光的干涉作用。,光,特点：色散后的光谱，各谱线间距离相等，是均匀分布的连续光谱。,61,2）准直镜：以狭缝为焦点的聚光镜。将发散光变为平行光，将色散后的平行光聚焦。,62,3）狭缝：狭缝宽度直接影响分光质量。过宽，单色光不纯，太窄，光通量小，降低灵敏度。,63,吸收池（比色池、比色皿）,2）用玻璃制成的吸收池，只能用于可见光区。,3）用石英制成的吸收池，可用于紫外光区。,1）型号有：0.5、1.0、2.0、5.0cm,64,4）吸收池两光面易损蚀，应注意保护， 装溶液时，要擦净。若被污染，要洗净。,使用前进行检查：,透光率检查：以空气为参比,空气T%=100%，比色皿应T%84%,65,5）使用时：应选择透光率误差小于0.5%比色皿配对使用。,配对性检查：,溶液于440nm处测定透光率。,6）应注意比色池在光路中的位置要正确。,66,检测器 将光能转变成电能的装置。,光电池：是一种光敏半导体。,要求：灵敏度高，噪声低,分类：硒光电池和硅光电池。,特点：光电流大小与照射光强成正比。 光电流不易放大，光强弱时，不能测量。 易“疲劳”，不能长时间使用。,A,67,光电管,光,阳极,光敏阴极,放大器,指示器,特点：电流可放大，较有高灵敏度。 有“疲劳现象”,68,光电倍增管,光,档板,倍增极（共9个）,阳极,光电倍增管大大提高了仪器测量的灵敏度。,69,光二极管阵列检测器：由一系列的二极管紧密排列在一块硅晶体片上组成。,光,例：HP8452A型二极管阵列：波长范围为190-820nm，二极管316个。,A,特点：测量速度快,70,信号显示系统（记录系统）,分类：指针显示 数字显示,T%,0,100%,50%,0,A,721型分光光度计显示系统,T%,100%,50%,0,A,721型分光光度计显示系统,71,三、几种光路的仪器,1、单光束（传统）,特点：仪器结构简单，灵敏度高，但对光源发光强度稳定性要求高。,72,2、双光束：普遍被采用。,特点：可减免因光源强度不稳而引入的误差，但灵敏度较单光束差。,73,3、二极管阵列,特点：全波长测定，测定速度快。,74,5 分析方法,一、定性方法,光谱特征：光谱形状、吸收峰数目、吸收 峰波长位置（峰形、峰数、峰位）,定性依据：1、结构相同的化合物在相同条件 下有完全相同的吸收光谱。,2、吸收光谱不同，一定不是相同物质。,3、吸收光谱相同，可能是相同物质。,75,1.比较吸收光谱,将试样与标准样品谱图或文献所载的标准图谱进行核对。,定性鉴别方法：,76,醋酸氢化可的松,醋酸可的松,醋酸泼尼松,局限性：不同种化合物可以有雷同的吸收光谱，因此得到相同的吸收光谱，应考虑并非同一物质的可能。,77,对比法,1、比较吸收光谱特征数据max 、max一致性,安宫黄体酮,决诺酮,78,2、比较吸光度（吸光系数）的比值,不只一个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处测得吸光度比值作为鉴别的依据。可消除绝对误差(或浓度、吸收池厚度)。,例：中国药典规定：B12在361nm、278nm吸光度的比值应为1.70-1.88;361nm、550nm比值为3.15-3.45。,79,作用：推断发色团及其之间的共轭关系，推断分子的骨架。,、饱和碳氢化合物 这类化合物在200-400nm没有吸收，在紫外吸收光谱分析中常用作溶剂。,二、结构分析,80,3、含有K带吸收，有共轭双键。,2、在200nm左右有吸收，可能有孤立双键。,4、含有R带吸收，有CO等键,5、含有B带，有苯环,81,三、纯度检测：,1、杂质检查,A 化合物 无吸收 杂质 强吸收 则含少量杂质可用光谱检查出来,82,B 化合物 强吸收 杂质 无吸收 杂质存在使化合物的表观吸收系数值降低,C 化合物 强吸收 杂质 更强吸收 杂质存在使化合物的表观吸收系数值升高,83,2、杂质限量检测：,肾上腺素中含杂质肾上腺酮 在310nm处，A0.05,310nm,肾上腺酮,肾上腺素,84,5 定量分析方法,测定条件：,波长的选择 控制A大小 选择合适的溶剂,85,选择合适的溶剂,选择原则：a 安全、无毒,b 被测物的溶解度大 C 不干扰：许多溶剂本身在紫外光区有吸收峰，所选用的溶剂应不干扰被测组分的测定。,截止波长：10mm光径长度透过率25%（A=0.6020）的波长。,组分的测定波长必须大于溶剂的截止波长。,86,一些常用溶剂性质,87,注：使用易挥发性溶剂，最好用带盖的样品池，以防溶剂挥发，改变样品浓度。,综上所述：常用溶剂中水