蛋白质的通性、纯化与表征.ppt

,第03章 蛋白质的性质和分离纯化 Properties and Purification of Protein,蛋白质是一种两性电解质,1、蛋白质的酸碱性质,pH=6,蛋白质份子表面分布着不同的电荷。,蛋白质等电点：使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等时溶液的pH值为蛋白质的等电点（pI）。 蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。,蛋白质溶液处于等电点时，溶解度最小。,由于蛋白质表面极性基团形成的水化膜，非等电状态时，同种电荷的互相排斥，质点大小在1-100nm，故蛋白质水溶液是胶体溶液。,稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 水化层(hydration shell);静电排斥：,2、蛋白质的胶体性质与沉淀,一旦电荷被中和或水化膜被破坏，在蛋白质的疏水作用下，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。,蛋白质沉淀(precipitation)的方法,重金属盐沉淀法：pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子结成不溶性沉淀（Ca 2+、Mg 2、Ba 2+、Pb 2+与羧基结合；Mn 2、Zn 2、Fe 2+、Cu 2+、Co 2+、Ni 2+与羧基、含氮化合物及杂环化合物结合；Ag+、Hg 2+、Pb 2+能与巯基结合）。重金属沉淀的蛋白质常是变性的。,有机溶剂沉淀法：与蛋白质份子争夺水分子，破坏蛋白质表面的水化膜，降低介电常数。使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇等。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。,盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。蛋白质不变性。,生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电点时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。,加热变性沉淀：将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，热稳定性差的蛋白质将发生变性而凝固沉淀。,3、蛋白质的分离纯化,蛋白质分离纯化的总目标：增加制品的纯度或比活性（单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性）。,3.1.1 前处理(pretreatment)释放蛋白质 将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波处理 植物组织和细胞：石英砂+提取液、研磨、纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理 收集细胞的某一组分：差速离心法 如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。,3.1 一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存,3.1.2 粗分级(rough fractionation)去杂质蛋白质和其它大分子 一般用选择性沉淀法：盐析（例如用(NH4)2SO4分级沉淀）；等电点选择性沉淀法；有机溶剂分级沉淀法；热处理选择性沉淀法；生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法,3.1.3 细分级（fine fractionation)纯化 透析除盐；凝胶过滤除盐； 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）； 电泳法； 密度梯度离心。,3.1.4 浓缩与保存 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH等。 冻干粉保存：在冷冻状态下让样品中的液体升华。 溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后-20-70保存。,蛋白质分子的大小：透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 蛋白质溶解度：盐析、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀 蛋白质电荷状况：凝胶电泳、等电聚焦、离子交换层析 蛋白质吸附性质：羟基磷灰石吸附层析、疏水作用层析 蛋白质生物学亲和性：亲和层析,3.2 常见蛋白质分离纯化的方法与原理,透析：半透膜阻留pro分子，而让小的溶质分子（无机盐）和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸，单糖等）。 超滤：施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子。,1）透析和超滤,2）凝胶过滤层析（GFC）,Vt-Vo 或 Vi+Vm,Vt,Vo,分离介质:凝胶颗粒（交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖等），具有不均匀的网状结构 分离机制：分子筛效应，即根据蛋白质分子大小不同来分离蛋白质，大分子物质最先流出柱外，小分子物质最后流出柱外。,分配系数Kd,可以把凝胶层析看成是液-液分配层析。固定相是凝胶珠内部水相（Vi），流动相是凝胶外部水相（Vo）。Kd为样品在两相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部水和外部水中的分配系数，它只与被分离物分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的粗细长短无关，也就是说它对特定物质为常数，与柱的物理条件无关。 Kd = (Ve-Vo)/Vi,在限定的层析条件下，Vt和Vo都为恒定值，Ve值是随着分离物分子质量的变化而变化的。分离物分子质量大，Kd值小；反之，Kd值增大。,(3)当01，表示凝胶对分子有吸附作用，此时VeVo+Vi，例如一些芳香族化合物苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在Sephadex G-25中的Kd值分别为1.2，1.4和2.2。,(1)当Kd = 0时，分子根本不能进入凝胶内部 (全排阻)，洗脱体积等于空隙容积，即Ve = Vo (I)。,(2)当Kd = 1时，分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为外水体积与内水体积之和，即Ve=Vo+Vi ()。,Kd可以有下列几种情况,分子量大洗脱体积小，分子量小洗脱体积大,常用于： 分离纯化蛋白质(包括酶类)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物； 还可用于: 测定蛋白质的分子质量，样品的浓缩和脱盐等方面。,3）有机溶剂沉淀法,定义 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法。,原理 亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加。,水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，减少了溶质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。,特点 有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。,4）等电点沉淀,定义 利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法。 原理 当溶液pH值为蛋白质的等电点时，分子表面的净电荷为零，导致蛋白质表面双电层和水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。 特点 等电点沉淀法操作十分简单，试剂消耗少，给体系引入的外来物也少，是一种有效的蛋白质初级分离方法，尤其对疏水性较强的蛋白质。其主要优点在于很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价格低廉，因此可以省去除酸的步骤。,电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。,5）聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳,（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳。,分离机制：电荷效应和分子筛效应,通电,等电聚焦电泳：在凝胶中建立pH梯度，当蛋白质移动到其等电点的pH时，净电荷为零，在电场中不再移动而聚集。 IEF分离蛋白质靠分子筛效应和电荷效应，可分离pI仅差0.01的蛋白质，分辨率高。,（2）等电聚焦电泳(isoelectric focusing, IEF),6）亲和层析,lgMr abVe,4.1 凝胶过滤法测定蛋白质分子量,依靠分子筛效应分离蛋白质，适应球状蛋白的测定,4、蛋白质相对分子质量的测定,SDS-PAGE：在聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇，以此凝胶为支持物的电泳称为SDS-PAGE。,SDS和巯基乙醇存在的情况下，蛋白质在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子量的大小，与蛋白质本身电荷的多少和形状无关，即只有分子筛效应。,4.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量,4.3 沉降分析法测定相对分子量,沉降速度：与蛋白质的大小、密度、形状以及溶剂的密度和粘度相关。,沉降系数S用高速离心机测定,Ultracentrifugation,5、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,5.1 蛋白质含量测定,总蛋白含量分析： 凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法。 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot),5.2 纯度鉴定（均一性）,基本手段：电泳分析：单条带。 选用手段：沉降分析、溶解度分析、结晶分析（能结晶的一般