蛋白质纯化色谱技术.ppt

2019/8/9,第四讲 蛋白质纯化色谱技术,一、色谱技术概述 二、凝胶过滤色谱（GF） 三、离子交换色谱（IEX） 四、疏水色谱（HIC） 五、反相色谱（RPC） 六、亲和色谱（AC）,一、色谱技术概述,色谱法，层析法，色层法（Chromatography） 是一种 “分离检测” 的“定量定性” 分析方法 19031906 俄国科学家Tswett发明 分类：色谱分离方法很多，种类有四、五十种 按大类分类法： 液相色谱（Liquid Chromatography） 气相色谱（Gas Chromatography） 按原理分类法： 按形式分类法： 按工作压力分类法：,色谱技术（分配色谱）,概念： 色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（分离介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,基本组成,流动相,泵,分离柱,检测器,输液,分离,检测,数据记录,进样器,进样,色谱图,输液泵,流速 压力 精度 脉冲 保养 梯度形成,进样阀,样品,采样位置,废液,流动相,接色谱柱,手动（六通阀）进样器,（）,（）,定量环,层析柱（填料/介质）,分离的关键场所 使用方法不同，先查阅说明书 注意清洗保养 防止气泡进入 样品及缓冲液的预处理 保湿,填料（层析介质）,蛋白质实验技术层析纯化,分离官能团； 基质骨架； 粒径/分辨率；,层析柱,监测器,紫外监测器 电导监测器 pH值监测器 保养与寿命,收集器Fraction Collector Frac-950,Rack types,4 x 96-well plates (deep or normal) + 8 x 30 mm,120 x 18 mm + 8 x 30 mm (standard rack),240 x 12 mm,操作系统,色谱系统,层析系统（蛋白纯化设备）,AKTA prime,AKTA purifier,Existing KTA range,KTAexplorer-fast method development,KTApurifier-high performance,KTAFPLC,KTAprime,18,Downstream setup,STREAMLINE 200 column, containing 5 L of STREAMLINE rProtein A in expanded mode,100 L scale fermentor,1997-06-16,19,KTA,means real genuine true,KTAdesign - an evolving platform,1996: KTAexplorer - methods and process development 1997: KTApurifier - peptide and nucleic acid purification 1998: KTAFPLC - high performance protein purification 1999: KTAprime - simple protein purification 2000: New fraction collector, sample pump and software,1997-06-16,21,KTAexplorer,Fast method and process development and scale-up for proteins, peptides and nucleic acids,Fully equipped for development tasks,Options: Autosampler Sample pump Air sensors,1997-06-16,22,KTApurifier,High performance purification and characterisation of peptides and nucleic acids,Options: Autosampler Sample pump Valves Air sensors,Optimised for high performance purification,1997-06-16,23,KTAFPLC,High performance purification of proteins,Reliable, well proven technology,Options: Valves Sample Pump Air sensors,1997-06-16,24,KTA prime,Reliable, well proven technology,Options: Valves Sample Pump Air sensors,色谱操作一般过程,色谱分离的基本概念,分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度,分配系数,蛋白质实验技术层析纯化,指一定温度下,处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。 K 固定相溶质浓度/流动相溶质浓度 分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。,保留时间（tR）和 保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱 过程的基本热力学参数之一,阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,理论塔板数,蛋白质实验技术层析纯化,number of theoretical plates 色谱的柱效参数,用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。,色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N-理论塔板数 tR-保留时间 W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度 理论塔板高度：L-柱长,分辨率(Resolution),蛋白质实验技术层析纯化,分离度(Rs); 表示两个洗脱位置相邻的溶质相互分离的程度。,相关视频,Tricorn柱装填； XK柱装填； 柱效检测。,凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography ) 也称大小（体积、空间）排阻色谱，是一种根据分子的大小和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。 利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，（在其分离范围内）按分子大小将样品中各组份分离开来。大分子先被洗脱，小分子后被洗脱。,二、凝胶过滤色谱,凝胶过滤色谱原理,分子量测定,脱盐,Sephadex系：是以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶。 经典的凝胶介质 Sepharose系: 经过纯化的琼脂糖，含极少的带电集团。 型号最多、应用最广 Sephacryl系：有是丙基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙稀酰胺共聚而成。 经济高效 Superdex系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的复合凝胶。 最新，选择性强，分辨率极高,常用的凝胶介质,脱盐： Sephadex G10、25 缓冲溶液交换：Sephadex G10、25 中间纯化： Sephadex G200 精纯 ：Sephacryl 、Superdex,常用的凝胶介质的应用,建议流速2039cm/h,建议流速3060cm/h,色谱条件的选择,凝胶介质：分离范围、分辨率。微粒越小，柱效越高，峰形越狭窄，分离度越高。 流速：孔径较小较结实的填料，耐受的流速要高于孔径大的填料。 上样：上样量；样品浓度70mg/ml。 压力监控。,三、离子交换色谱 Ion Exchange Chromatography，IEX,分离原理： 根据蛋白质的带电类型（阳离子或阴离子），以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法,阴离子交换色谱原理,基质,基质,基质,官能团,二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）,原理,蛋白质实验技术层析纯化,分离谱,蛋白质实验技术层析纯化,色谱条件,pH： 阴离子交换层析：蛋白质带负电荷，则要求pHpI，但不能高于介质功能基团的pK； 阳离子交换层析：蛋白质带正电荷，则要求pHpI，但不能低于介质功能基团的pK；,色谱条件,缓冲溶液： 阴离子交换层析：Tris-HCl 阳离子交换层析：PB 上样： 盐浓度 上样量：载量（吸附层析） 样品蛋白浓度不可过高（低于10mg/mL）； 须经离心或过滤处理,吸附速度： 洗脱方式： 改变离子强度、 pH层析聚焦（Chromatofacusing ） 等梯度洗脱 阶段洗脱 梯度洗脱 洗脱速度：阶段洗脱可尽量大；梯度洗脱需根据出峰情况调整。,洗脱,蛋白质实验技术层析纯化,线性洗脱,梯度洗脱,梯度洗脱,离子交换剂的选择,考虑因素： 酸碱强弱：由功能基团决定 稳定性 再生性 经济,离子交换剂的选择,常见类型,纤维素类：无定形，分辨率和稳定性都较低 葡聚糖系：体积和流速受PH值、离子强度影响较大； 琼脂糖系：最常用 聚乙烯醇系(Toyopearl)：全合成的 苯乙烯系（Source）：流速快，分辨率高,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,Source 系列离子交换剂 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低 阳离子交换树脂 S系列 阴离子交换树脂 Q系列 MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。 同样分为Q系列和P系列,常见问题分析,不吸附：缓冲溶液PH不对；离子强度太高； 峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲溶液不纯 分辨率低：梯度太大；流速太高 前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生 峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀,四、疏水性相互作用色谱 (Hydrophobic Interaction Chromatography）,Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity,“盐促吸附层析” 在适当高盐浓度下，蛋白质的疏水残基与固定相上的疏水配基产生吸附作用。,Mechanism of HIC,Na2SO4 1.0 M,疏水色谱操作,疏水色谱特点,特点：它分离效率高，上样量大，特别适合分离盐析沉淀的样品。 填料：烷基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶，丁基琼脂糖凝胶，辛基琼脂糖凝胶等。,疏水层析VS反相色谱,同： 分离介质（固定相） 吸附原理 异： 作用强弱 用途,五、反相色谱,原理：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子迁移速度快而先被洗脱下来。 一般使用甲醇、乙腈作流动相，使得蛋白质容易变性失活； 常用于HPLC分析，与在水-有机相中稳定的多肽和低分子量蛋白质的分离。,反相液相色谱,反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性,载体：微粒多孔硅胶（粒径5m20 m ） Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基 流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃,Source RPC,Influence of Particle Size on the Separation effect,六、亲和色谱 （Affinity chromatography）,载体活化、配基连接、吸附、洗脱,原理,蛋白质实验技术层析纯化,分离谱,蛋白质实验技术层析纯化,填料（层析介质）,蛋白质实验技术层析纯化,骨架 偶联配基,应用,蛋白质实验技术层析纯化,抗体纯化； IgG蛋白A 重组融合蛋白 （His）6标签蛋白纯化 金属离子螯合剂 GST标签蛋白纯化 谷胱甘肽 固相载体偶联配基； ,缓冲液,蛋白质实验技术层析纯化,缓冲液A： 缓冲液B：含竞争配体,亲和层析操作,蛋白质实验技术层析纯化,81,82,Principles of operation,Before start-up sedimented adsorbent,Equilibration (expanded),Sample application Washing (expanded),Elution Regeneration (packed bed),83,Expansion vs. fluidization,Expanded bed No pressure drop over the bed Particles move freely in solu