微生物实验室良好规范.pptx

微生物实验室良好规范 USP Best Practices,August 2016,微生物实验室良好规范,无菌技术 培养基管理 菌种管理 设备操作与管理 认真的记录与数据评估 人员培训 微生物数据 天生不确定性，高风险 重现性与可靠性取决于采用的方法与操作规范,培养基管理,优质培养基取决于 制备 存储 质量控制 干粉培养基 成品培养基 分析证：外购培养基 有效期 储存条件 质控用菌种 培养适用检验,培养基配制,水 纯化水：最佳 去离子水或蒸馏水：可用 低于此质量水：不宜使用 必须记录配制水量 称量准确 天平经过校验，称量范围适用 称量容器与工具：清洁 记录称量成份,培养基配制,干粉培养基： 应充分溶解后再分装与灭菌 不得过分加热 配制用设备 可控制加热过程： 培养基颜色加深（梅拉得反应或非酶解褐变反应） 恒定搅拌 混和均匀 玻璃容器：清洁充分 防止抑菌物：来自于洗涤剂或遗留物质 用纯化水充分冲洗洗涤剂,培养基灭菌,按供应商建议或经过验证 商业化培养供应商提供灭菌方法 优先湿热灭菌：热敏感成分除外 无菌过滤 灭菌方法与条件：验证 无菌验证 促生长实验 湿热灭菌验证：121C/15min 热分布 装载方式与装置量 装载量过多：灭菌时间可以延长 灭菌柜升温过慢：培养基会过热,培养基灭菌,灭菌冷却后，应立即取出培养基 否则培养基会过热 灭菌不当： 培养基变色 培养基变混 胶体粘性改变 pH改变 促生长实验结果变小 生长选择性变差,培养基灭菌,灭菌后pH测定 冷却至室温20-25C 测定pH：无菌取样 外购冷藏培养基：测定pH之前应加热至室温 扁平pH探头：琼脂表面 浸入式探头：液体培养基 pH认可范围：与厂家标定值比较：0.2,培养基储存,供应商发货前：贮存与运输方式 全过程不得影响培养基水份 控制温度 防止微生物污染 机械保护 培养基标识 批号 制备日期 有效期 名称,培养基储存,供应商建议 自行配制培养基：验证后的储存条件 不得0或低于0储存）冷冻会破坏培养基胶体结构 避光、密闭、避免水份流失,培养基溶解,只允许一次 避免过热与污染 水浴加热或自由流动蒸汽（无压力） 微波炉或加热板： 使用时避免过热 注意安全 熔化的琼脂培养基： 水温45-50 , 不超过8小时 培养基分装：水浴水不得流入分装容器,培养基质量检查,质量影响因素 原始成份来源差异：天然产品 批与批之间一致性 制备过程 储存条件 影响结果 微生物生长情况 回收率 结果不可靠,培养基质量检查,自制培养基 pH 促生长实验 制备与灭菌验证之后：可只对进厂干粉 否则每批做 抑菌性 特性检查 定期稳定性检查：确认有效期 促生长实验用检定菌 药典要求 供应商指定 环境分离菌 (非药典要求）,培养基质量检查,容器或盖子是否有裂纹 装量不均匀 脱水导致固体培养基表面皴裂或凹陷 溶血现象 颜色过深或变色 冷冻后形成结晶 微生物污染 氧化还原指示剂状况 (redox indicator) 批号与有效期检查，做出记录 无菌性 平板清洁状况 (盖子不得粘附于平板）,培养基质量检查,有效期：促生长实验数据支持 有效期结束时 与培养基成分、配方、保存容器类型相关 促生长实验失败 调查与整改 同时出现的阳性结果： 阳性结果不可认定为无效,菌种鉴别试剂,类别，如 革兰氏染色剂 氧化酶实验试剂 质量检查 选择正确标准菌 生产厂家建议 使用前质量检查,无菌检验与无菌环境监测培养基,双层包装 最终灭菌 若非最终灭菌，使用前必须100%预培养 预培养之后：必须促生长实验 防止关键区域污染 防止假阳性结果 接触碟：必须检查琼脂培养基是否有突起,菌种管理,菌种管理,使用与储存：一致性 菌种来源 国家菌种中心或有资质的供应商 冷冻、冻干、斜面或即时使用型 菌种鉴别与纯度：使用前确认 即时使用型：使用前进行纯度与鉴别检查 至种和属,菌种管理,菌种制备与复苏 供应商建议 验证的成熟方法 储存原始菌种：使用批号技术 国家菌种中心或合格供应商菌种 原始菌种首次传代： 在低温保护培养基中制备悬液，转移至试管，在-30 以下保存，供下次使用。 若-70C或冻干保存，菌种可长期保存。 每月从冷冻管制备工作菌悬液； 打开使用后的冷冻管：销毁，避免失活或污染,菌种管理,工作控制菌的传代次数：transfer 可追踪 过度传代：增加表形变化或变异的风险 应具体规定次数 subculture 传代的定义 passage 将存活菌种转移至新鲜培养基继续生长 任何形式的移植培养subculture都认定为传代 transfer / passage,实验室设备,微生物实验室设备,培养箱 水浴 灭菌柜 必须进行正式验证、定期校验（每年） 新设备、关键操作设备 根据QA批准的方案进行确认 日常清洁： 培养箱、冰箱、水浴 减少微生物污染 培养箱与冰箱门密封条 清洁与检查,微生物实验室设备,pH计、分光光度计 定期校验 日常检查 无法消毒的设备：冰箱、培养箱 无菌操作设立专用冰箱或培养箱 无菌培养基储存专用 无菌样品培养专用 菌种操作与处理专用,微生物实验室设备,灭菌柜 验证与确认 灭活专用,布局与操作,微生物实验室布局与操作,分区 洁净区(无菌区) 有菌区 环境监测样或无菌产品样品处理与培养区 不得有存活微生物：尽可能 至少应有物理隔离 无菌衣 消毒过程 仅用于洁净或无菌操作的生物安全柜 建立泄漏或事故处理程序 所有相关人员培训,微生物实验室布局与操作,样品长菌 需要进一步分析鉴别 立即移出洁净区 有菌区 分离、染色、微生物鉴别、调查 只能在有菌区进行 有微生物生长的任何样品 不得在洁净区打开 避免假阳性,微生物实验室布局与操作,取样人员： 不得进入菌种操作区 若需进入 ： 必须穿戴防护服、手套、退出时仔细消毒 尽量不在实验室菌种操作区域附近工作 样品污染： 随时可能发生，造成假阳性结果 原材料、辅料取样：控制环境中 适当着装、灭菌取样工具 公用系统取样：如，水，无菌取样方式,微生物实验室布局与操作,环境监测取样 仪器设备的摆放与移除对无菌操作要求较低 设备仪器应同时与微生物培养基同时摆放 各类无菌检验：应在控制环境中进行 无菌制剂 原料药 发酵菌种 生物制品菌种 隔离器 ,样品操作,样品操作,操作与储存条件：关键 微生物样品：水、环境监测样、生物负荷样 关键参数： 样品成分 包材成份 储存时间 储存温度 取样操作至检验开始的时间 严格控制 期间的储存条件 样品转移到较远处检测 运输条件确认：时间、温度等 USP 医药用水,样品操作,取样前样品混和： 必须评估与确认 确保样品代表性 微生物分布 微生物样品 取样操作：无菌取样技术 取样区域：无菌取样区 取样区域尽可能接近取样点 减少样品运输途中污染,培养时间,微生物培养基培养时间,培养时间的表达： 若小于3天，应准确到小时， 30-35, 18-72hrs 至少培养至时长下限，超出时间进行评估 检验时间大于72小时，按天表达 30-35, 3 5天 上午或下午开始培养，也应同样时间结束,人员培训,人员培训,微生物学教育背景 员工 主管 经理 职责明确 操作规程的培训 检验方法描述 文件编号便于检索化验员接受的培训内容 建立个人培训档案 确认后方能独立操作 培训记录时效性：现行版本与SOP,人员培训,化验员定期技能(核心操作)评估： 卫生 制备双碟 无菌操作 记录 主管或经理 检验操作水平至少等同于其下级化验员 主管技能 实验室安全 计划 预算 调查技术 技术报告编写 SOP编写，等,人员培训,能力证明 课程教育 相关经验 继续教育 培训证书 主管能力 微生物知识与技能 学院课程教育 培训证书,人员培训,公司管理层责任：确保微生物检验负责人 理解微生物学基本原则 有良好知识与能力解释并掌握法律法规 与员工有良好沟通能力，在理论与实际操作上指导化验员 微生物学 工作的严谨性、科学性 与化学分析、工程技术不同 没有特殊的人员无法从事此项工作,资源,实验室资源,实验室管理人员的职责 实验室能力评估要素 调查的案例数 时间：样品接收至开始检验 时间：检验结束至开具报告 上述时间过长 实验室资源与人员不足 预算充足 可靠检验结果的保证,记录,记录管理 受控的证据,化验员培训与能力证明 设备验证、校验与维护 检验过程中设备性能 (24小时/7天记录) 培养基制备、无菌检查、促生长实验、选择能力 培养基库存与质量检验 操作程序规定的关键操作 数据与计算核实 QA或授权经理审核报告 数据偏差调查,化验室记录的维护,化验室记录应包括的要素 日期 样品名称 化验员姓名 规程号 记录检验结果 偏差 参数记录 设备、微生物菌种、培养基批号 主管/复核人签名,化验室记录的维护,记录 关键设备，按期校验、有维保记录、使用日志 设备温度（水浴、培养箱、灭菌柜），可追溯 SOP SOP名称与版本号 方法描述应具体详细 书写修改： 单线划掉，签字、日期 原数据不得擦掉、或涂抹 检验结果 原始平板计数：便于复核 图表：装订应安全、数据可读；骑缝签字,化验室记录的维护,笔记本 页码 目录 索引（SOP与执行文件号） 使用期限 记录保存 正式文件规定各类记录保存期限,检验结果,微生物结果表达与解释,检验结果与预期明显不同：并不重要，因为 各类自然界普遍存在的菌，也是常见环境污染菌 取样与处理样品过程：化验员可能带入污染 样品或环境微生物菌分布不均匀 微生物结果变化性大 检验操作尤其重要 微生物结果来源 可能的污染 药品、辅料或检验环境 （如丝状真菌）,微生物结果表达与解释,出现不符合标准结果时 偏差调查 实验差错 实验环境污染 产品微生物限度超标 应立即通知实验室主管和QA,微生物结果超标调查,微生物实验室条件彻底调查 所有与微生物相关条件和因素 实验室环境 样品保存条件 历史结果 样品特性：微生物存活