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第 30 卷 第 6 期 高 师 理 科 学 刊 Vol. 30 No.6 2010 年 11 月 Journal of Science of TeachersCollege and University Nov. 2010 文章编号:1007-9831(2010)06-0060-03 动物源乳酸菌的筛选与特性研究 肖静 1,薛春梅2,梁秀娟3,刘晓兰1,孙剑秋1,吴耘红1,李波1 (1. 齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院,黑龙江 齐齐哈尔 161006;2. 佳木斯大学 生命科学学院,黑龙江 佳木斯 154007; 3. 齐齐哈尔市质量技术监督局,黑龙江 齐齐哈尔 161006) 摘要:从健康的鸡、鼠、兔肠道内容物及胃内分离得到 6 株乳酸菌,通过单层平板扩散试验筛选 出了 3 种有明显抑菌活性代谢产物的乳酸菌用盐酸和过氧化氢对照实验,排除酸和过氧化物的 干扰,用胰蛋白酶处理后抑菌活性明显降低,确定该乳酸菌能够发酵生产细菌素类抑菌物质 关键词:乳酸菌;细菌素;抑菌实验 中图分类号:Q939.11 +7 文献标识码:A doi:10.3969/j.issn.1007-9831.2010.06.021 乳酸菌主要分布于矿物质和有机营养物丰富的微酸性环境中,食品(如青贮饲料、果酒啤酒、泡菜、 酱油、酸奶、干酪) 、蔬菜等材料中都富含乳酸菌,此外,动物消化道等也是乳酸菌的重要来源 1-2乳酸 菌对动物的营养和健康有重要作用,具有抑菌消炎,抗氧化、抗肿瘤,降低胆固醇,提高免疫力等功效 3-4 本文从鼠、兔等材料中分离获得产中温淀粉酶芽孢杆菌基因资源的同时 5,分离获得了 6 株动物源乳 酸菌,并对其发酵产物的抑菌性等进行了研究,以进一步探讨不同来源的乳酸菌的抑菌谱差异,丰富乳酸 菌的菌种资源 1 实验材料和方法 1.1 材料 实验动物购于农贸市场;胰蛋白酶和过氧化氢酶购自 Sigma;其它化学试剂为国产分析纯 1.2 指示菌 大肠杆菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌 006 等由齐齐哈尔大学微生物实验室提供 1.3 培养基 MRS 液体培养基:蛋白胨 10 g、牛肉膏 10 g、酵母提取物 5 g、柠檬酸二铵 2 g、乙酸钠 5 g、K2HPO4 2 g、MnSO44H2O 0.25 g、MgSO47H2O 0.58 g、葡萄糖 20 g、吐温80 1 mL、水 1 000 mLpH6.26.4 MRS 固体培养基:在上述配方中加入琼脂 25 g,pH6.26.4 改良的 MRS 培养基:MRS 固体培养基中加入 1% CaCO3 改良的牛肉膏蛋白胨培养基: 牛肉膏 0.5%、 葡萄糖 0.5%、 酵母提取物 0.5%、 蛋白胨 1%、 氯化钠 0.5%、 琼脂 2.5%,pH7.27.6 1.4 实验方法 1.4.1 乳酸菌的采集 取样:从市场购买成年鸡、兔、鼠 3 种实验动物,解剖,分别取鸡胃、鸡小肠、兔 小肠、鼠胃,用 75%的酒精对其表面进行杀菌并用无菌水清洗后,再用手术刀剪开,材料置于 30 mL 无菌 水中,100 r/min 摇床振荡 30 min 后,吸取 0.5 mL 上清液加入 4.5 mL 无菌水试管中,编号为 A,B,C,D, 进一步进行系列稀释制成 10 -110-10的菌悬液 收稿日期:2010-09-10 基金项目:黑龙江省科技厅技术研究项目(10553119) ;齐齐哈尔市科技局项目(GYGG-0811) 作者简介:肖静(1974-) ,女,黑龙江齐齐哈尔人,副教授,博士,从事微生物、生物技术研究E-mail:xiaojing8168 第 6 期 肖静,等:动物源乳酸菌的筛选与特性研究 61 培养:取 0.2 mL 自行制备的菌悬液涂布于改良的 MRS 培养基平板上,37培养 4872 h,分离纯化并 观察记录菌落特征 菌种初步鉴定:革兰氏染色,选取革兰氏阳性的菌体进行镜检并进行生理生化鉴定,包括接触酶试验, 需氧性试验和生长 pH 试验等 6 1.4.2 乳酸菌的发酵 挑取培养14 h的乳酸菌34环, 分别加入装有30 mL的MRS液体培养基中, 37 120 r/min 摇床培养 12,24,48 h 时,分别取适量发酵液 12 000 r/min 离心 10 min,上清液作为待测样品,进行 pH 值测定和抑菌测定 1.4.3 乳酸菌发酵液中抑菌活性的确定 将大肠杆菌等 6 种指示菌菌悬液涂布平板温育 15 min 后,将 6 株 乳酸菌的发酵液上清液吸附在滤纸片上,置于指示菌平板表面,温育 2 d 测量其抑菌圈大小 1.4.4 抑菌物质化学本质的确定 酸对照试验:用与发酵液 pH 相同的盐酸作对照进行乳酸菌抑菌性测试 酶处理试验:上清液中分别加入过氧化氢酶和蛋白酶,37温育 2 h 后进行抑菌试验,以未加酶的发 酵原液作为对照 2 结果分析 2.1 菌落特征和菌体特征 从 3 种动物小肠或胃中获得 6 株乳酸菌,均为革兰氏阳性菌,菌落乳白色,菌体杆状,不产生芽孢, 兼性厌氧,接触酶反应阴性,能够在 pH4.5 条件下生长,初步鉴定该 6 株乳酸菌为乳杆菌(Lactobacillus) 2.2 抑菌性的测定 对 6 株乳杆菌进行发酵,取 12,24,48 h 的发酵上清液进行抑菌活性测定,结果见表 1 分离获得的 6 株乳酸菌中,Lactobacillus 1, Lactobacillus 2,Lactobacillus 3 等表现出了广谱 的抑菌活性12,24,48 h 的发酵产物对革兰氏 阳性菌枯草芽孢杆菌、 芽孢杆菌 006 和革兰氏阴 性菌产气肠杆菌均有抑制作用发酵 12 h 时, Lactobacillus 3 对芽孢杆菌 006、枯草芽孢杆菌、 产气肠杆菌的抑菌圈直径分别达到 1.8,1.8,1.6 cmLactobacillus 4 在发酵 12,24 h 分别表现出了不稳定 的对芽孢杆菌和产气肠杆菌的抑菌活性,可能跟抑菌物质在发酵过程中的稳定性有关 2.3 抑菌性物质的化学本质 通过酸对比和加酶处理实验,确定上清液中抑菌物质的化学本质,其中发酵过程中发酵液的 pH 变化 见表 2 根据相应发酵液的 pH 设置酸对比实验中的空白对照 以抑菌活性最高的 Lactobacillus 3 为例测定酸处 理和酶处理对抑菌活性的影响,见表 3 与 Lactobacillus 1 和 Lactobacillus 2 相比,Lactobacillus 3 具有更高的抑菌活性,与发酵液 pH 相同的 HCI 未显示抑菌作用,用过氧化氢酶处理发酵液,对抑菌作用没有明显影响但是,当用胰蛋白酶对发酵 液进行处理,抑菌活性降低了 50%左右 综上所述,从动物肠胃分离获得了 6 株乳杆菌,其中 3 株乳杆菌对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有 抑制作用Lactobacillus 3 发酵周期短,抑菌性较强,能以乳酸菌素为主要物质进行广谱抑菌,加之来源于 动物的天然安全性,有望应用于动物饲料的乳酸发酵,增加饲料的利用率的同时,提高动物健康饲养水平 表 2 不同发酵时间乳杆菌发酵液的 pH 乳酸菌 发酵时间/h 菌 1 菌 2 菌 3菌 4 菌 5 菌 6 12 4.5 4.0 5.54.0 6.0 4.5 24 3.5 3.5 4.53.5 5.5 3.5 48 3.5 3.0 4.53.5 5.0 3.5 表 3 发酵 12 h 乳酸菌发酵上清液的抑菌情况 cm 菌种 菌 1 发酵液 菌 2 发酵液 菌 3 发酵液 HCl 对照 A1A2 芽孢杆菌 0061.0 1.3 1.8 - 1.11.7 产气肠杆菌 1.2 1.4 1.6 - 0.91.5 枯草芽孢杆菌1.0 1.4 1.8 - 1.01.6 注:A1为胰蛋白酶处理后的菌 3 发酵液;A2为过氧化氢酶处理后的 菌 3 发酵液 表 1 发酵不同时间的乳酸菌发酵液的抑菌情况 h 大肠杆菌 产气肠杆菌枯草芽孢杆菌 芽孢杆菌 006 乳酸菌 12244812244812 24 48 122448 菌 1 菌 2 菌 3 菌 4 菌 5 菌 6 - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + - - - + + + + - - + + + - - - + + + - - - + + + - - - + + + - - - + + + + - - + + + - - - + + + - - - 62 高 师 理 科 学 刊 第 30 卷 参考文献: 1 杭柏林,胡建和,刘丽艳,等2 株乳酸菌对鸡源致病性大肠杆菌的体外抑制试验J饲料研究,2008(8) :33-35 2 吴惠芬,毛胜勇,姚文,等猪源乳酸菌产乳酸及其抑菌特性研究J微生物学通报,2005,32(1) :79-84 3 NANCY J G, Tony S Selection and characterization of mixed starter culters for lactic acid fermentation of carrot, cabbage, beet and onion vegetable mixture JInt J Food Microbiol,2001,64:261-275 4 马静静,王小芬,程序,等乳酸菌发酵使木薯淀粉残渣饲料化研究J农业工程学报,2008,24(6) :267-272 5 孙静,路福平,杜连祥,等枯草芽孢杆菌工程菌产中温-淀粉酶的发酵条件优化J中国酿造,2009(5) :65-68 6 杜连祥乳酸菌及其发酵制品生产技术M天津:天津科学技术出版社,1999:2-30 Study on isolation and characteristics of lactic acid bacteria from animals XIAO Jing 1,XUE Chun-mei2,LIANG Xiu-juan3,LIU Xiao-lan1,SUN Jian-qiu1,WU Yun-hong1,LI-Bo1 (1. School of Life Science and Agroforestry,Qiqihar 161006,China;2. School of Life Science,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China; 3. Qiqihar Administration of Quality and Technology Supervision,Qiqihar 161006,China) AbstractAbstract: Eleven strains of lactic acid bacteria were isolated from gastro-intestinal, and gastric of a health chickens, rats,rabbitsThrough single-level slab proliferation experiment screening out three strains of lactic acid bacteria which has obvious bacteriostasis functionIt is the product of the metabolism of lactic acid bacteriaUsing HCl contrast experiments,exclude acid disturbance,activeness obviously reduced after trypsin processing,with catalase processing,the bacteriostasis effect was invariable,explained the catalase has not affectedThus knew in the bacteriostasis matter has the bacteriocin of protein category Key wordsKey words:lactic acid bacteria;bacteriocin;bacteriostasis experiment (上接第 48 页) 参考文献: 1 Wang Zhongli, Wang Xianghua On an extention of Hadamard inequalities for co- nex functionsJ China Ann. of Math., 1982 (5) : 567-570 2 冯慈璜关于凸函数的Hadamard不等式J数学年刊,1985,6(4) :443-446 3 Dragomir S SOn Hadamard ,s inequality for the convex mappings defined on a ball in the space and applications JMathematical Inequalities and Application,2000,3(2) :177-187 4 王福利经典Hadamard不等式的高维推广J数学的实践与认识,2006,36(9) :370-373 5 王良成凸函数的Hadamard不等式的若干推广J数学的实践与认识,2002(1) :1 027-1 030 6 Dragomir S S,Cho Y J,Kim S SInequalities of Hadamard type for Lipsch-Tzian Mappings and Their ApplicationsJJournal of Mathematical Analysis andApplications,2000(245) :489-501 7 Zhang X M, Chu Y M A Double Inequality for the Gamma and Psi FunctionsJ International Journal of Modern Mathematics, 2008, 3(1):23-27 8 华云关于GA凸函数的 Hadamard 型不等式J大学数学,2008,24(2) :147-149 9 张孔生,万建平P凸函数及其性质J纯粹数学与应用数学,2007,23(1) :130-133 10 宋振云,涂琼霞P凸函数的一个充要条件J高师理科学刊,2010

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