发酵法生产多价不饱和脂肪酸的研究.pdf

技术 进展 P ro g re s 精 细 与 专 用 化 学 品2 0 0 2 年 第 12 期 ( )( )( C C C C C C CCC CC C C C C C C C C C C C C C CHCCC C C CCC 栏 目名 称 ： “ 九 五 ” 国 家科 技 攻 关“ 轻化 工 生物 技 术 新 工 艺新 产 品” 项 目系列报 栏 目主 持 ： 科 学技 术部 中国生物 工程 开发 中心 、 中国化 工 信 息 中心 内容 审核 ： 张木 、 于希 椿 、 宋宗 文 之 十 八 0 oooo 发酵法生产多价不饱和脂肪酸的研究 华南理工大学生物工程系 姚 汝华 潘 力 罗立 新 林 炜铁 。 摘要 一 亚麻酸在 医药、 食品、 化妆品和饲料领域拥有 9 广 阔的应用前 景 ， 研 究发现采用 小于 1 6 糖 浓度 的流加工艺进 行发酵时 ， 一 亚麻酸产量为 2 4 g L， 生产周期短， 生产消耗低，5 适 合实际生产应 用 ， 适 宜 的产 物 提 取方 法 是 乙醇一 正 己烷 两步2 法 ； D H A、 E P A等不饱 和脂肪酸 主要结合在 甘油 的 2 一 位 ， 利 用脂 肪酶对油脂选择性水解的特点对鱼油进行水解反应可以达到 2 富集多价不饱 和脂肪酸 的 目的 ， 筛选 了两种 目标酶并 研究 了其 固定化方法； 用被孢霉属菌株在 1 0 0 L发酵罐中生产花生四烯 5 酸 ， 菌干重 可达 3 6 g L ， 花生 四烯 酸达 4 9 g L 。 关键词 一 亚麻酸花生 四烯 酸D H A发酵法 R&D 0 f P r o d u c t i o n 0 f P0 l v u n s a t u r a t e d 5 Fa t t y Ac i d V i a F e r me n t a t i o n Ya o Ruhu a Pa n Lf Lno Li xi n Li n We i t i e Ab s t r a c t L i n o l e n i c a c i d a r e e n j o y i n g w i d e a p p l i c a t i o n i n 6 p h a r m a c e u t i c a l ， f o o d ，c o s me t i c s a n d f e e d I t h a s b e e n d i s c o v e r e d 9 t h a t t he y i e l d o f Li n o l e n i c a c i d c a n r e a c h 2 4 g L t h r o ug h flu i d a d d i n g p r o c e s s f e rme n t a t i o n w i t h s a c c h a r i d e c o n c e n t r a t i o n l e s s t h a n 9 1 6 Thi s me t h o d i s s ui t ab l e f o r c o mme r c i a l i z e d pr o du c t i on wi t h s h o r t c y c l e a n d l o w C O S t T h e f e a s i b l e e x t r a c t i o n m e t h o d o f L i n o 一6 l e n i c a c i d i s t h e t w o s t e p p r o c e s s w i t h e t h a n o l 一 t h e x a n e U n s a t u r a t 一2 e d f a t t y a c i d s u c h a s DHA，EPA mos t l y c o mbi ne s g l y c e r i n e a t 2 - p o s i t i o n，p o l yu n s a t ur a t e d f a t t y a ci d c a n b e e n r i ch e d b y fis h o i l h y d r o l y s i s u nd e r t h e u n de r s t a n di ng t ha t l i p as e p o s s e s s e s t he c h a r a c t e r i s t i c o f s e l e c t i v e h y d r o l y s i s o f o i l a n d f a t s T w o k i n d s o f o b j e c t i v e e n 一5 z y m e h a v e b e e n s c r e e n e d a n d t h e i r i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d h a s b e e n 9 s t ud i e dAr a c h i d o n i c a c i d c a n b e p r od u ce d i n 1 00L f e r me n t e r b y u 一 s i n g s t r a i n o f m o r t i e r e l l a w i t h a n y i e l d o f d r y h y p a s e o f 3 6 g L a n d 9 a r a c hi d on i c a c i d o f 4 9g L Ke y wo r d s y - L i n o l e n i c a c i d ，a r a c h i d o n i c a c i d ，D H A，f e r 一5 ： m e n t a t i o n 2 oo o o o oooooo o o o 1 4 价 不 饱 和 脂 肪 酸 ( P U F A s ) 主 要 包 括 一 亚 麻酸 ( G L A) 、 双高 一 亚麻 酸 ( D H L G) 、 花 生 四烯 酸 ( A R A) 、 二 十碳 五 烯 酸 ( E P A) 和二 十 二碳 六 烯 酸 ( D H A) 等 。P U F A s 对 心 脏 疾 病 、 高 血 压 、 炎 症 和某 些 癌 症 的 预 防 和治 疗 均 有 显 著 效果 ， 在医药 、 食 品、 化妆 品和饲料领 域拥有广 阔 的应 用 前景 。 P U F A s 的 自然 来 源 主 要 是 动 植 物 ， 由于 易 受气 候 、 产 地 等 环境 条件 的影 响 ， 不 能满 足社 会 需求 。微 生物 具 有 生 长 周 期 短 、 培养 简 单 和 不 受 原 料 限 制 等 特 点 ， 所 以利 用 微 生 物 发 酵 生 产 多 价 不 饱 和 脂 肪 酸 已成 为 近 几 年 研 究 的 热 点 。 日本 、 美 国等 国家 已先 后 问世 了一 系列 多 价 不 饱 和脂 肪 酸 的 发 酵 产 品 ， 如 一 亚 麻 酸 、 双 高 亚麻酸和花生 四烯酸。国内在这一领域的研究 开 始 较 晚 ， 还 存 在 着 发酵 产 量 低 及 油 脂 的分 离 纯化 困难 等一 系列 问题 。从微 生 物 发酵 生产 的 角度 出发 ， 尚需在多个方面加强研究工作 ， 包括 研究微生物体 内 P U F A s的生物合成途径 和代 谢调控机制 ， 采用现代 生物技术 如基 因工程和 原生质体融合对菌种进行改造 ， 改进发酵工艺 ， 降低 发酵成本 ， 建立简单高效 的 P U F A s 提取浓 缩 技术 。 华 南 理工 大学 和 中科 院 上海 有 机化 学研 究 所 、 大 连轻 工 业 学 院 承 担 了 “ 发 酵法 生 产 多 价 不饱 和脂 肪 酸 ” ( 9 6 一 C 0 3 - 0 1 4) 的 “ 九 五 ” 攻 关 课题 ， 分 别对 一 亚 麻 酸 、 花 生 四烯 酸 和 D H A进 行 了微生物发酵的研究 ， 在菌种选育、 发酵工艺 的优化 、 分离提取和功能性食 品的开发等方面 都 取 得 了一 定 的成 绩 ，并建 立 了 D HA、 E P A 的 维普资讯 精 细与 专 用化 学 品2 0 0 2年 第 1 2期 酶法富集工艺。经专家鉴定 ， 该专题完成 了合同规 定 的指 标 ， 在 不饱 和 脂 肪 酸 的发 酵工 艺 、 酶法 富集 等 技 术上 有 明显 的进 步 ， 在 某 些 方 面 处 于 国 内领 先 水 平 。 1 多价 不饱和脂 肪酸 发酵与提 取的研 究 1 1 一 亚麻 酸发 酵 研 究 “ 九 五 ” 国家攻 关 计 划 中 ， - 亚 麻 酸 发 酵 的研 究 是 国家 “ 八 五 ” 攻 关 项 目的 延 续 ， 在 前 期 研 究 的基 础 上 ， 筛选到两株高油脂得率 、 高生物量 、 高 亚麻酸 产率的高产菌株 ， 进行 了中试发酵条件 的优化 、 产物 提 取 、 中试 和功 能性 食 品 开发 的研究 。 1 1 1 摇 瓶 和 5 L 、 3 0 L发 酵 罐 阶段 由于该高产菌株 在发酵过程 中强烈产酸 ， 因此 在摇 瓶 发 酵 条 件 下 不 易 控 制 p H 值 ， 不 能 采 用 过 高 的糖浓度 ， 一般 以 1 0 的糖浓度 较合理 ， 在该条 件 下 ， - 亚麻 酸 产量 约 为 1 6 g L 。 在 小罐 试 验 阶 段 ， 溶 氧 水 平有 了改 善 ， 并采 用 了 流 加工 艺 和 p H 调 节 方 案 ， 致 使 - 亚 麻 酸 产 量 有 较 大提 高。采用 1 8 ( 流加 8 ) 糖 浓度时 ， - 亚麻 酸 产量 达 2 6 g L 。 1 1 2 5 0 0 L罐 中试 阶段 在 大罐 发 酵 时 ， 菌 体 多 数 呈 2 mm 小 球 状 ， 菌 体 生长 量 很 大 ， 因此 对搅 拌 强 度有 一 定 要求 ， 尤 其 是在 大罐 中发 酵 ， 搅 拌 轴 功 率 不 足就 成 了限 制 发 酵 的一 个 关 键 因素 。选育 的 菌 种 是 一 株 耐 高糖 的 菌 株 ， 但 过高 的糖浓度对发酵设备 的要求较 高 ， 在实 际生产 中并 不 实用 。该 菌 种 有 自凝 聚 特 性 ， 在 发 酵 时 多 数 呈 球状 ， 密 度 大 ， 很 容 易 分 离 ， 所 以 增 加 发 酵 液 的体 积 对 菌体 的分 离基 本 上 没 有 任 何 负 担 ， 从 经 济 上 考 虑 ， 在 实 际 生 产 中 采 用 初 低 糖 流 加 对 发 酵 更 有 利 。 通 过 中试 发 酵 实验 ， 发 现 采 用 小 于 1 6 糖 浓 度 的流 加工艺 ， 在生产 中较容 易控制 ， 对设 备 的要求 也不 高 ， 尽管 一 亚麻 酸 的产 量相对高糖浓 度要低一 些 ， 但 发 酵后 干 菌体 量 、 菌 体 油脂 得 率 都 比较 高 ， 生产 周 期短 ， 生产消耗低 ， 更适 合于实际生产应用 。 以 1 6 的糖浓 度 进 行 发酵 时 ， 一 亚麻 酸 产量 为 2 4 g L 。 1 1 3 3 0 0 0 L罐 中试 阶段 利用筛选出的高产菌株 N1 1 8在 3 0 0 0 L罐进行 发酵 中试 ， 连续 8个 罐 批 获 得成 功 ， 最 后 全 部 达 标 ， 发 酵 7 2 h后 干菌 体 量 在 5 5 4 以 上 ， 干 菌 体 中油 脂 得 率 为 4 1 左 右 ， 一 亚 麻 酸 在 油 脂 中 的 含 量 超 过 技术 进展 P ro g re s s 1 5 。 I 1 4 产 物提 取 的 研 究 产物提取采用 了有机溶剂法和超临界萃取法 ， 有 机溶 剂法 是 工 业 化 油 脂 生 产 常 用 的方 法 ， 提 取 效 果最 好 的是 氯 仿- 甲醇 正 丁 醇 水 E D T A( 2 ： 1 ： 1 ： 1 ： 0 1 ) 法 ， 用 该 方 法 提 取 - 亚 麻 酸 得 率 和 含 量 都 比较 高， 其 次是乙醇- 正 己烷 两步法 ， 前一种 方法溶剂 配 比复杂 ， 溶剂 回收困难 ， 不 易操 作 ， 后一方法相对简 单 ， 适合于产业化生产。超 临界萃取法对 - 亚麻 酸 油脂萃取 ， 以不带夹带剂 的高纯 C O 萃取较好 ， 油 脂纯度高 ， y - 亚麻酸含 量也较 高 ， 并 对 C O 超临界 国产装 置 提 取 y 一 亚 麻 酸 油脂 进行 了研 究 。 1 2花生 四烯酸 发 酵研 究 从 自然界 ( 陆上 、 海 洋 等 处 ) 采 集 土样 、 植 物 花 、 叶 、 果 、 水 样 等 8 5 0个 样 品 ， 从 中分 离 到 产 花 生 四烯 酸 的菌 株 1 5支 ( 主要 是 霉 菌 ) ， 通 过 摇 瓶 试验 ， 从 这 1 5支菌 株 中筛 选 出 一 花 生 四烯 酸 高 产 菌 株 F - 4 0 8 。 该菌 株 在摇 瓶 中菌 体 干 重 达 1 2 5 g L ， 花 生 四烯 酸 产 率为 1 4 5 g L 。 经 鉴定 ， F - 4 0 8是 一 株 被 孢 霉 属 ( Mo r t i e r e l l a ) 的 菌株 。实验 发 现 ， 菌 体 形 态 和液 体 培 养 条 件 有 相关 性 ， 随着 培 养条 件 的变 化 ， 它 的形 态 也 能 改 变 ， 从 而 也就影响菌体的产量及花生四烯酸的产率。当菌体 在液体培养基 中形成小球时 ， 菌体生长速率变慢 ， 菌 体 干重及花生四烯 酸产率就减 少 ， 而当菌体形态为 丝状时 ， 菌体生长速率加快 ， 菌体干重及花生 四烯酸 的产 量 就增 加 。在 培养 基 中投 加 不 同颗 粒 大小 的不 溶物 ， 可以影响菌体 的形态， 例如玻璃球 、 塑料颗粒 、 玉米粉 、 黄豆粉 、 硅胶等。实验 发现 ， 投加玉米粉或 黄豆 粉 能形成 生 长 良好 的 菌 丝 体 ， 菌 丝 能 达 2 5 4 g L ， 花生 四烯 酸产 量也 达 2 0 1 g L 。 花 生 四烯 酸存 在 于菌 体 的脂 质 成 分 中 ， 增 加 菌 体 中类 脂 成 分 的 重 量 是 增 加 花 生 四烯 酸 的首 要 条 件 。花 生 四烯 酸 的前 体 是 亚 油 酸 、 亚麻 酸 ， 因 此 ， 在 培 养基 中增 加一 些 亚油 酸 或亚 麻 酸也 能 增加 花生 四 烯 酸 的产 量 。改 变 菌体 培 养基 中 C ： N 比例 ， 就 能 改 变菌体 的类脂代谢或蛋 白质代谢 ， 当碳源大大多于 氮 源 时 ， 也 就 是 菌 体 繁 殖 到 一 定 量 时 ， 只供 给碳 源 ， 菌体就只进行类脂代谢 ， 就可 以大量积 累类脂化合 物 。另外 ， 培养 基 中添 加一定 量的植物 油 ( 其 中含 有 大量 的亚 油 酸 、 亚 麻 酸 ) 也 能 促 进 花 生 四烯 酸 的 积累。用葡萄糖作碳源能取得较好的菌干重和花生 7 5 维普资讯 技术 进展 P ro g re s 精 细 与 专 用 化 学 品2 0 0 2 年 第 1 2 期 四烯 酸 ， 当葡 萄 糖 的添 加 量 达 到 1 5 0 g L时 ， 菌 干重 可 达 3 0 g L左 右 ， 花 生 四烯 酸也 能 达 4 5 g L左 右 。 当添 加 同样 的 玉 米 油 ( 5 0 g L) ， 则 每 升 产 的 花 生 四 烯 酸要 高于 葡 萄糖 ， 能 达 1 6 7 g L 。 在摇 瓶 成 功 的基 础 上 ， 先 进 行 了 1 0 L发 酵 罐 的 放 大试 验 ， 结 果 比较 理 想 。 在 1 0 0 L发 酵 罐 的 中试 放 大 中 ， 发 酵 周 期 为 7 天 ， 最 后 菌 干 重 可 达 3 6 g L ， 花 生 四 烯 酸 收 率 可 达 4 9 g L 。花 生 四烯 酸 油脂 的提取 采 用有 机 溶 剂 法进 行 。 1 3 鱼油 中提取 D H A、 E P A及 其衍 生 物 的研 究 分 析脂 肪 酸在 脂 肪 中 的 分 布情 况 发 现 ， 多 价 不 饱和脂肪 酸主要结 合在 甘油 的 2 一 位 。利用脂 肪酶 对 不 同位 置 脂 肪酸 选 择 性 切 除 的 特 点 ， 使 用 脂 肪 酶 对 鱼油 进 行 水解 反 应 ， 可 以达 到 富集 多 价 不 饱 和 脂 肪 酸 的 目的。 1 3 1 脂肪 酶 酶源 菌 株 的 筛选 选 育 出 了 3株 酶 源菌 株 ， 分 别 是 T r i c h o s p F i g u e r i a e J - 0 9， Rhi z o p o s a r r h i z u s ZM一 93 3， Rh i z o p us c hi ne n s i s WZ H一 8 ， 均产 1 ， 3位 置 特 异 性 脂 肪 酶 ， 后 两 株 主 要 是 胞外 脂 肪 酶 。 经诱 变后 ， 筛 选 出 高 渗 透 性 抗 阻 遏 突 变 菌 株 ， 其 酶 活 力 达 到 3 4 5 u m l ， 提 高 活 力 达 8 0 。诱 变 后 ， R h i z o p o s a r r h i z u s Z M- 9 3 3和 R h i z o p u s c h i n e n s i s WZ H一 8 分 别 提 高 胞 内 酶 活 性 2 8 和 3 1 。研 究 还考 察 了产 酶 条 件 、 酶 的 动 力 学性 质 和 限制 性 水 解 鱼 油 效 果 的 比较 ， 最 终 选 择 R h i z o p u s c h i n e n s i s WZ H 一 8和 R h i z o p o s a r r h i z u s Z M- 9 3 3作 为 限 制 性水 解 鱼 油 的 目标 酶 。 1 3 2 固定 化 技 术 比较 了 几 种 固定 化 方 法 ， 特 别 是 液 晶 和 固 态培 养 载 体 在位 固定化 胞 内脂 肪 酶技 术 。这种 固定 化技 术采 用 载体 固态 培 养 ， 在 位 固定 化 方 法 ， 废 水 少 ， 固 定 化 酶 的半 衰 期 为 3 5天 。 1 3 3 酶 法 富集 一 3 P U F A 反应 体 系 与工 艺 条件 比较 了水 体 系 、 水 一 有机 溶 剂 二 相 体 系 和乳 化 体 系对 水 解 速率 的选 择 性 影 响 。二相 体 系有 利 于 水解 速率和鱼油浓度的提高。研究考察了水解率及其他 条件 与 D HA、 E P A 富 集 浓 度 之 间 的关 系 ， 优 化 了 限 制性 水 解 工艺 条 件 。 同时研 究 了固定 化 酶 的半 衰 期 及 反应 器 ， 也 研 究 了酯 化 法 富 集 D H A、 E P A 的工 艺 条件 。结 果 表 明 ： 限制 水 解 法 富 集 D H A、 E P A 的 收 率 可 以达 到 4 0 5 3 ( 因鱼 油 品种 差 异 而不 同 ) 。 1 6 1 4产 品后 加 工 及功 能 性食 品的 开发 测定 了微 生 物 发 酵 生 产 的 y 亚 麻 酸 油 脂 的部 分 生 理 活性 指标 ，动 物试 验 表 明 ，y 一 亚 麻 酸 能 显著 增 强 体外 抗 氧 化作 用 ，具 有显 著 的抗 凝 血功 能 ；对 增 强 小 鼠短 时 记忆 能 力 有较 显 著 作用 。经上 海 市技 术 监督 局 批 准 、全 国食 品 添加 剂 委 员会 审批 ，y 一 亚 麻 酸 已获准 为 食 品添 加剂 ，并 被 编入 食 品添 加 剂手 册 。 产 品后 加 工及 功 能性 食 品的 开发 研究 主要集 中 在 以下几 个 方 面 ： ( 1 )将 提 取或 提 纯 的 多价 不饱 和 脂 肪 酸用环 糊 精 包埋 ， 得 到含 有 多价 不 饱 和脂 肪 酸 的环 糊精 粉 末 ， 添 加 到牛 奶 或奶 粉 中 ， 得 到多 价 不饱 和 脂 肪 酸 分 散 均 匀 的牛 奶 或奶 粉 。 ( 2 )以阿拉伯胶及酸式 明胶为囊材制备菌油微 囊 ， 添 加 到食 品或 饮料 中生产 强 化 营养 产 品 。 ( 3 )以鸡 蛋蛋 白为乳 化 剂 ， 以 明 胶 和 菌 油 为 原 料 制 备类 似 深海 鱼油 的胶 囊 。 ( 4 )从 菌 油 中提 取 的油 脂 直接 作 为食 用 油 的添 加 剂 。 ( 5 )将 发 酵所 得 的 菌 体或 提 取所 得 的多 价 不饱 和脂肪酸作为动物饲料 添加剂 ， 可以提 高动物的健 康水平并获得富集 了多价不饱和脂肪酸 的蛋、 奶和 肉等 。 鱼油 来 源 的多 价 不饱 和脂 肪酸 最 大 的缺点 就 是 腥 臭 味 ，本 项 目在 微 囊化 技 术 方 面取 得 了较 大 的进 展 ，研究 考 察 了 两 种 微 囊 化 技 术 ，即 相 分 离 一 冷 冻 干燥法和喷雾干燥法。对囊材配方 的操作参数进行 了优化。两种方法仍存在 的问题是 ，在微囊表面仍 沾 有 残余 油 ，容易 氧 化 ，特 别 是 喷雾 干燥 法 ，产 品 经 喷 雾 干燥 后 难 以再 除 去这 些 表 面 附油 ，而 相分 离 一 冷冻干燥法不仅避免 因温度高 引起 的氧化 ，而且 附油 容易 除 去 ，既 可 制成 湿 品 也可 制 成 干品 。脱 臭 鱼油 制成 的微胶 囊 化 产 品 ，制 成 冰激 淋 和雪糕 后 不 影 响 风 味 。其 它指 标 均达 到或 超过 预 定 目标 。 为 了 提 高 体外 与 体 内抗 氧 化性 ，除 了选 择 囊 材外 ，酶 法 合成 了 一 3 P U F A衍 生 物 ，即 - 3 P U F A与磷 脂 合 成 酯 ( 一 3 P U F A P C) 和 一 3 P U F A 的 维 生 素 E 酯 ( 一 3 P U F A V E) 。 制 成 胶 囊 后 ，经 6个 月 常 温 贮 存 ，其 抗 氧 化 性 能 优 于 一 3 P U F A E t 和 甘 油 酯 型 P UFA。 ( 下转 第 1 1页) 维普资讯 精 细 与 专用 化 学 品2 0 0 2年第 1 2期 4 4软 铣焊 性试 验 在涂 有 免清 洗 助 焊剂 的清 洁铜 板 中央 放 上 H L S n P b 5 0铣 料 ， 铣料 上 分 别滴 上 两滴 助 焊剂 。然 后 置 于 2 7 5 的恒 温 箱 内 1 mi n ， 取 出测 其 漫流 面 积 ， 由此 可 知助 焊 性 能 的强 弱 。 口 参 考文 献 1 吴贵芬 免清洗助焊 剂 电子工艺技术 1 9 9 5 ， 4 ： 9 - 1 1 2 徐大林 表 面组 装 件制 作 中 的免 清洗 工 艺技 术 电子 工 艺技 术 1 9 9 9 ， 9： 1 7 9 1 8 1 ( 3 D D P a t 2 7 8 5 3 0 4 谢 飞 替代 O D S清洗剂 精细与专用化 学品 1 9 9 9 ， 2 2 ： 1 6 1 8 5 陈其垠 免清洗助焊 剂 MN C T的研 制 1 9 9 9， 1 1 ： 2 4 5 2 4 6 6 F J 贾思基 C N P a t 1 ， 1 0 1 ， 5 9 8 A 1 9 9 5 7 雒社 教 CN P a t1 ， 1 3 1 ， 0 7 0 1 9 9 5 8 薛树 满 C N P a t 1 ， 1 1 0， 2 0 5 1 9 9 6 9 李圣 波 C N P a t 1 ， 2 0 9， 3 7 4 1 9 9 5 1 0 李圣波 C N P a t 1 ， 2 0 9， 3 7 5 1 9 9 5 1 1 S a m u e l V B ri s t o 1 U S P a t 5， 0 0 4， 5 0 9 1 9 9 1 1 2 B ri s t o 1 U S P a t6 ， 1 7 0 ， 7 3 5 2 0 01 1 3 B ri s t o 1 U S P a t 6 ， 1 9 3 ， 8 1 2 2 0 0 1 1 4 B ri s to 1 U S P a L 6 ， O 1 O。 5 7 7 2 0 O 0 消费Gl u ,ral 1 5 B ri s t o 1 U S P a t 5。 5 0 7 8 8 2 1 9 9 6 1 6 G a o U S P a t 5， 9 5 8 ， 1 5 1 1 9 9 9 1 7 G a o U S P a t 6， 0 5 6， 1 8 9 2 0 0 0 1 8 S t e n f a n o w a s k i U S P a t5， 2 8 1 ， 2 8 1 1 9 9 4 1 9 S t e n f a n o w a s k i U S P a t5， 3 3 4， 2 6 0 1 9 9 4 2 0 P e n n i s i U S P a t5， 1 3 6， 3 6 5 1 9 9 2 2 1 M A l e r t WO P a t9 ， 9 0 3 ， 5 9 7 1 9 9 8 2 2 Di a ma n tU S P a t 5 ， 8 5 1 ， 3 1 1 1 9 9 8 2 3 Di e p Q u a n g U S P a t 5 ， 9 0 4， 7 8 2 1 9 9 9 2 4 Z h o u U S P a t 5 ， 9 8 5， 4 5 6 1 9 9 9 2 5 Z h o u u S P a t 6， 1 3 2， 6 4 6 2 0 0 0 2 6 Ma c e U S P a t 5， 0 0 4， 5 0 8 1 9 9 1 2 7 Min a h a r a U S P a t 5 ， 3 3 4 ， 2 6 1 1 9 9 4 2 8 Z h o u U S P a t 5， 9 8 5， 0 4 3 1 9 9 9 2 9 S c h n e i d e r U S P a t 5。 5 7 1 ， 3 4 0 1 9 9 6 3 0 T a k e z a w a U S P a t 5， 8 1 7， I 9 0 1 9 9 8 3 1 Dia ma n tU S P a t 5 ， 9 8 9， 3 6 2 1 9 9 9 3 2 I t o U S P a t 5 ， 9 0 7 ， 0 0 7 1 9 9 9 3 3 T a n a h a s h i U S P a t 5， 9 1 9， 3 1 7 1 9 9 9 3 4 S c h n e i d e r U S P a t 5， 2 9 7， 7