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第 29 卷第 10 期农 业 工 程 学 报Vol.29No.10 2013年5月Transactions of the Chinese Society of Agricultural EngineeringMay 2013287 琥珀酰化修饰改善牦牛乳酪蛋白胶束结构及疏水性 杨 敏 1,2,3,梁 琪1,2,毕 阳1,文鹏程1,2,张卫兵1,2,杨继涛3 (1. 甘肃农业大学食品科学与工程学院,兰州 730070; 2. 甘肃省功能乳品工程实验室,兰州 730070; 3. 甘肃农业大学理学院,兰州 730070) 摘要:琥珀酰化是改善食品蛋白质功能性质的常用手段,牦牛乳是青藏高原特色乳资源。为了揭示琥珀酰化对 牦牛乳酪蛋白胶束结构的修饰作用,以牦牛乳酪蛋白为原料,研究了琥珀酰化修饰对其结构及疏水性的影响。分 别通过傅里叶变换红外光谱分析了修饰前后酪蛋白胶束二级结构变化,采用动态光散射技术分析了修饰前后酪蛋 白胶束粒径变化,采用扫描电镜技术观察了酰化反应对酪蛋白的表面形貌的影响。结果显示,牦牛乳酪蛋白胶束 二级结构为 33.1% - 转角、23.2%无规卷曲,32.0% - 折叠和 11.7%大环结构, - 螺旋结构未检出。琥珀酰化修饰 后, - 螺旋结构形成,含量为 12.4%,其他二级结构含量变化不大。琥珀酰化修饰使酪蛋白胶束粒径减小,由不 规则的球形转变为规则的球形,疏水性显著降低。研究结果可为牦牛乳酪蛋白的改性提供参考依据。 关键词:化学修饰,蛋白质,红外光谱,牦牛乳酪蛋白,琥珀酰化,胶束结构,疏水性 doi:10.3969/j.issn.1002-6819.2013.10.038 中图分类号:Q518.4文献标志码:A文章编号:1002-6819(2013)-10-0287-06 杨敏,梁琪,毕阳,等. 琥珀酰化修饰改善牦牛乳酪蛋白胶束结构及疏水性J. 农业工程学报,2013, 29(10):287292. Yang Min, Liang Qi, Bi Yang, et al. Succinylation improves structure and hydrophobicity of yak casein micellesJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2013, 29(10): 287292. (in Chinese with English abstract) 0引言 牦牛是中国古老而原始的牛种之一,是青藏高原 特有的优势畜种,牦牛乳是牦牛最大宗的产品。牦牛 乳蛋白质为46.258.4g/L, 总酪蛋白含量为40.2g/L, 均高于荷斯坦牛乳1- 2。近年来,牦牛乳产量大幅度增 加,世界年产量约为4000 万t。中国牦牛乳年产量约 为400万t, 但用于工业化乳制品加工的用量不足25%, 除少量被牧民饮用外,其余大部分经脱脂、沉淀、干 燥后制成曲拉(藏语:奶干渣)3- 4。 牛乳经脱脂、酸沉淀、脱水、干燥后制成粉末 状制品即为粗制酪蛋白,又称干酪素。酪蛋白及其 制品有着较高的营养价值和良好的功能特性,适合 作为乳化剂、增稠剂和营养强化剂等,广泛应用于 食品工业、化学工业和医药工业4- 6。 化学修饰常用于改善蛋白质的功能性质,其 主要方法有酰化反应、酯化反应、糖基化反应、 磷酸化反应、烷基化反应等。其中,酰化修饰研 究较多7- 8。众多研究表明,蛋白质经过酰化修饰 收稿日期:2013- 02- 03修订日期:2013- 04- 22 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30960260) 作者简介:杨敏(1981) ,女,讲师,博士生,研究方向为乳品科 学与技术。兰州甘肃农业大学理学院,730070。 Email:yangmin 后, 净负电荷显著增加, 凝胶性变化显著8- 10。 然而, 酰化修饰对酪蛋白胶束结构及疏水性影响鲜为报 道,牦牛乳酪蛋白的酰化修饰相关研究未见报道。 本研究以琥珀酸酐为酰化试剂,研究了酰化修 饰对牦牛乳酪蛋白粒径、二级结构以及表面形貌的 影响,分析了酪蛋白胶束疏水性变化,旨在阐明琥 珀酰化修饰对牦牛乳酪蛋白部分理化性质的影响, 为牦牛乳酪蛋白开发与利用提供参考依据。 1材料与方法 1.1材料与仪器 粗制牦牛乳酪蛋白粉由甘肃华羚生物科技有限公司 提供, 其中酪蛋白质量分数为94.20%, 含水率为3.12%。 试剂: 乙醇(天津市凯信化学化工有限公司) ; 丁二酸酐(琥珀酸酐,天津市凯信化学工业有限公 司);氢氧化钠(天津市化学试剂三厂);盐酸(天 津市化学试剂三厂);邻苯二甲醛(上海中秦化学 试剂有限公司);亮氨酸(天津市凯通化学试剂有 限公司);硼砂(天津市凯通化学试剂有限公司); 十二烷基磺酸钠(鹏程公司);8- 苯胺- 1- 萘磺酸 (ANS,阿拉丁化学试剂有限公司)。 仪器:UV 2100 双光束紫外- 可见分光光度计 (北京北分瑞利分析仪器有限责任公司);精密电 子天平(上海良平仪器仪表有限公司);DF- II 集 农业工程学报2013 年 288 热式磁力加热搅拌器 (金坛市顺化仪器有限公司) ; PHS- 3C- 01 实验室 pH 计(上海三信仪表厂);立 式高速冷冻离心机(KR25i,法国 Jouan 公司); 激光光散射仪(BI- 200SM,美国布鲁克海文仪器公 司);GLZ- 0.4 冷冻干燥真空机(北京速原中天科 技有限公司);真空傅里叶红外光谱仪(VERTEX 70V,德国布鲁克仪器有限公司);内切式匀浆机 (XHF- D,宁波新芝生物科技有限公司);场发射 扫描电子显微镜(S- 4800,日立公司)。 1.2研究方法 1.2.1牦牛乳琥珀酰化酪蛋白的制备 准确称取 1.0 g 牦牛乳酪蛋白, 加入 100 mL 去 离子水中, 在 40磁力搅拌并用 1.0 mol/LNaOH 溶 液不断调节 pH 值使其稳定在 7.0 直至酪蛋白完全 溶解即得酪蛋白溶液。将溶液 pH 值调至 8.8,在 42磁力搅拌下分多次加入 0.6 g 琥珀酸酐,并不 断加入 1.0 mol/LNaOH 溶液使反应液 pH 值稳定为 8.8,总反应时间为 49 min。反应结束后,用 1.0 mol/LHCl 溶液将酰化后酪蛋白溶液 pH 值调至 等电点,于 3 500 g 离心 15 min,弃去上清液,将 沉淀置于钢制托盘进行冷冻干燥, 温度为- 50,真 空负压为 500600 Pa,时间为 24 h,得到白色粉 末状酰化酪蛋白制品备用。 酪蛋白酰化程度采用邻苯二甲醛法测定11- 12, 测得酰化酪蛋白的酰化程度为 90.02% 0.97%。 1.2.2牦牛乳酪蛋白胶束粒径的动态光散射测定 准确称取 0.5 g 牦牛乳酪蛋白及酰化酪蛋白, 溶解于适量去离子水中,于 40磁力搅拌,调节溶 液 pH 值为 7.0 直至酪蛋白完全溶解并定容至 50 mL,备用。取溶解后的酪蛋白溶液 20 mL 置于 样品瓶中,采用激光光散射仪在激光器的波长为 632.8 nm, 散射角为 90 的条件下进行扫描, 测定粒 径分布及微粒强度13。 1.2.3浊度测定 以 1.2.2 中制备的酪蛋白溶液为样品,蒸馏水 为参比,在 633 nm 波长下采用紫外- 可见分光光度 计测定酪蛋白溶液吸光度值,平行测定 3 次,取平 均值,即为浊度14。 1.2.4牦牛乳酪蛋白二级结构的红外光谱分析 取浓度为 10 mg/mL 的酪蛋白水溶液样品 2 mL,加入衰减全反射(attenuated total reflection, ATR) 样品池中,采集红外图谱, 扫描范围 4 500 650 cm- 1,仪器分辨率为 2 cm- 1,碲镉汞(mercury cadmium telluride,MCT)检测器采用液氮冷却。 以上测定均在室温下进行15- 16。 1.2.5牦牛乳酪蛋白形貌的扫描电镜观察 将切割好的硅片分别浸入乙醇和纯水中超声 处理 3 h, 将酪蛋白溶液滴在硅片上, 真空干燥 12 h, 真空度为 0.08 MPa。 采用场发射扫描电镜观察吸附 于硅片上的酪蛋白17。 1.2.6牦牛乳酪蛋白疏水性测定 1)内源荧光 准确移取浓度为 10 mg/mL 牦牛乳酪蛋白样品 100 L,加入 20.0 mL 去离子水并混匀。采用荧光 分光光度计在室温下测定其荧光发射光谱,激发波 长设定为 280 nm,发射光谱采集范围为 290 450 nm,激发波长和发射波长狭缝均为 5.0 nm,扫 描速率为 240 nm/min18- 19。 2)外源荧光 准确移取浓度为 10 mg/mL 牦牛乳酪蛋白样品 300 L,加入20.0 mL 去离子水,最后加入100 L 浓 度 为8.0 10 3mol/L的8-苯 胺 - 1-萘 磺 酸 (8- aniline- 1- naphthalene sulfonic acid,ANS)荧光剂, 振荡,静置 3 min。采用荧光分光光度计在室温下测 定其荧光发射光谱, 激发波长设定为390 nm, 发射光 谱采集范围为400650 nm,其他仪器参数同上20。 1.2.7统计学方法 各组数据均为 3 次试验的平均值,以平均值 标准差表示;数据采用 SPSS 18.0 进行统计分析; 采用 Origin 8.0 作图。 2结果与分析 2.1牦牛乳酪蛋白粒径分析 采用动态光散射仪测得酰化前后酪蛋白胶束 粒径分布如图 1 所示。 由图 1 可以看出,酪蛋白胶束粒径主要分布于 310390 nm,平均粒径为 360 nm,酰化后胶束粒 径主要分布于 170250 nm,平均粒径为 220 nm。 由此可见,酰化作用使得酪蛋白胶束粒径减小。这 是由于酰化反应后,酪蛋白胶束游离氨基变为亲水 性更强的琥珀酰基,促使酪蛋白的溶解性增加8, 部分胶束发生了解离,粒径变小。 a. 酪蛋白 a. Casein 第 10 期杨敏等:琥珀酰化修饰改善牦牛乳酪蛋白胶束结构及疏水性 289 b. 酰化酪蛋白 b. Succinylated casein 图 1酰化修饰对牦牛乳酪蛋白胶束粒径分布的影响 Fig.1Influence of succinylation on size distribution of yak casein micelles 对酰化前后的酪蛋白溶液进行浊度测定,结果 为酰化前浊度 0.622,酰化后浊度 0.185,说明酰化 修饰促使酪蛋白胶束解离,粒径减小,这与动态光 散射测定结果一致。 2.2牦牛乳酪蛋白胶束形貌的扫描电镜观察 采用场发射扫描电镜观察牦牛乳酪蛋白胶束 酰化前后的表面形貌,如图 2 所示。 a. 酪蛋白 a. Casein b. 酰化酪蛋白 b. Succinylated casein 图 2牦牛乳酪蛋白及酰化酪蛋白扫描电镜图( 50,000) Fig.2Scanning electron microscope photos of original and modified yak casein micelles( 50,000) 由图 2a 可以看出,牦牛乳酪蛋白胶束大小 不均匀,形状不规则,粒径较大,部分团聚在一 起。牦牛乳酪蛋白为盐酸沉淀酪蛋白,酸沉淀过 程中,胶束聚合而沉淀出。由于酸沉作用,酪蛋 白的溶解性变差,复溶后粒径较大,部分未能完 全溶解而呈现团聚状态,部分胶束溶解较彻底, 因此粒径分布范围较大。 酸沉牦牛乳酪蛋白胶束 整体呈现不规则形状,大致接近球形。由图 2b 可以看出, 酰化牦牛乳酪蛋白胶束粒径分布较为 均匀,多呈现球形,团聚现象明显减少。经过琥 珀酰化处理后,胶束表面和内部游离氨基被修 饰, 胶束所带负电荷增多, 胶束之间的斥力增大, 这使得胶束相互难以靠近,团聚现象减少7。酰 化酪蛋白胶束亲水性增强,溶解性增加,使得胶 束粒径减小, 表面形貌较为规则, 大小较为均匀, 基本恢复了胶束原有的球形21- 22, 有利于胶束的 稳定。 2.3牦牛乳酪蛋白胶束红外光谱分析 牦牛乳酪蛋白的红外光谱图及其酰胺带高 斯拟合图如图 3 所示。 采用红外光谱图分析软件 PeakFit4.12 对酪蛋 白的酰胺带 1 6001 700 cm- 1进行两点基线校 正,进行 9 点 Savitsk- Golay 函数平滑,做二阶导数 谱并采用 Gauss 峰形进行拟合,估算出子峰的个数 和位置,手动调整各子峰的峰高和半峰宽,多次拟 合使残差最小(r20.999),重叠在一起的不同谱 带 可 完 全 分 辨 , 如 图 3b 、 c 所 示 。 其 中 1 7001 660 cm- 1为 - 转角,1 6521 649 cm- 1为 - 螺旋,1 6481 641 cm- 1为无规卷曲,1 640 1 600 cm- 1为 - 折叠15- 16,23- 24。图 3b、c 包含了位于 (1 656 3)cm- 1的峰。众多关于蛋白质二级结构的 研究指出,(1 656 2)cm- 1的峰来源于大环结构 (large loop)25- 26。对谱图处理可能导致峰位置 2 cm 1范围的漂移,因此,本研究中将其归属于大环 结构。根据其积分面积计算各种二级结构的相对百 分含量,结果如图 4 所示。 a. 红外光谱图 a. Fourier transform infrared spectroscopy 农业工程学报2013 年 290 b. 酪蛋白酰胺带高斯拟合图 b. Gaussian curve fitting of amide I regions in casein c. 酰化酪蛋白酰胺带高斯拟合图 c. Gaussian curve fitting of amide I regions in succinylated casein 图 3牦牛乳酪蛋白及酰化酪蛋白红外光谱图 Fig.3Fourier transform infrared spectra of original and modified yak casein 图 4牦牛乳酪蛋白二级结构含量 Fig.4Content of secondary structure in yak casein from fourier transform infrared spectroscopy 由图 4 可以看出,牦牛乳酪蛋白二级结构以 - 转角、无规卷曲和 - 折叠为主,其百分含量分别为 33.1%、23.2% 和 32.0%。除此之外,含有 11.7%大 环结构。 - 螺旋结构在牦牛乳酪蛋白中未检出。琥 珀酰化修饰后, - 螺旋结构形成,百分含量为 12.4%,其他二级结构均有所降低,但降低幅度较 小。酰化修饰使酪蛋白胶束上的游离氨基转化为琥 珀酰胺基,带上了负电荷,氨基酸侧链之间的静电 斥力增大,促使 - 螺旋结构形成。综上所述,琥珀 酰化修饰促使酪蛋白形成了少量规则的 - 螺旋结 构,对其他二级结构含量影响较小。换言之,琥珀 酰化修饰不会显著改变由高级结构所决定的性质。 2.4牦牛乳酪蛋白疏水性分析 2.4.1内源荧光分析 牦牛乳酪蛋白及其酰化酪蛋白的内源荧光发 射光谱如图 5 所示。 图 5牦牛乳酪蛋白内源荧光发射光谱 Fig.5Fluorescence emission spectra of yak casein 由图 5 可以看出,牦牛乳酪蛋白最大荧光发射 强度为 751.22,酰化后减小至 529.16,最大发射波 长发生红移,由 339 nm 增大至 346 nm,由此可见, 琥珀酰化显著改变了酪蛋白色氨酸残基的微环境, 使酪蛋白的疏水性降低。有报道指出,最大发射波 长 max位于 335350 nm 表示色氨酸残基处于疏水 性环境中;max位于 350353 nm 表示色氨酸残基 暴露于亲水性环境中18。酰化修饰之前,牦牛乳酪 蛋白 max为 339 nm, 表明色氨酸残基处于疏水性环 境中,这与酪蛋白胶束本身具有较强疏水性密切相 关。酰化修饰后,氨基转化为琥珀酰胺基,酪蛋白 胶束亲水性增强,最大荧光发射强度降低,max增 大至 346 nm,色氨酸残基微环境疏水性降低。 2.4.2外源荧光分析 牦牛乳酪蛋白胶束的ANS荧光发射光谱如图6所示。 图 6牦牛乳酪蛋白 8-苯胺-1-萘磺酸 ANS 荧光发射光谱 Fig.6Fluorescenceemissionspectraof8- aniline- 1- naphthalene sulfonicacid(ANS)inyakcaseinsolution 由图 6 可以看出,牦牛乳酪蛋白的 ANS 荧光发 射光谱最大荧光强度为 304.63,max为471 nm,酰化 修饰后最大荧光强度降低为 53.38,max为 501 nm, 第 10 期杨敏等:琥珀酰化修饰改善牦牛乳酪蛋白胶束结构及疏水性 291 发生红移,由此可见,琥珀酰化显著降低了牦牛乳酪 蛋白的疏水性,这与内源荧光测定结果一致。ANS 荧光强度取决于发色团所处的微环境, 一般位于蛋白 质的疏水性区域。 ANS 阴离子与肽链上的阳离子残基 (如赖氨酸、精氨酸、组氨酸等)以静电作用力相结 合。与蛋白质结合的 ANS 阴离子越多,荧光强度值 就越大27- 29。琥珀酰化修饰后,绝大多数赖氨酸残基 发生了改变, 由于其氨基形成了琥珀酰胺键而带上了 负电荷,从而与 ANS 阴离子产生了静电斥力,使其 结合数量降低,因此荧光强度降低,最大发射波长发 生了红移,表现为酪蛋白疏水性降低。 3结论 对牦牛乳酪蛋白进行了琥珀酰化修饰,研究了 修饰前后牦牛乳酪蛋白胶束结构及疏水性变化。采 用傅里叶变换红外光谱分析修饰前后酪蛋白胶束的 二级结构发现,牦牛乳酪蛋白胶束二级结构以 - 转 角、无规卷曲和 - 折叠为主,其百分含量分别为 33.1%、23.2%和 32.0%,除此之外,含有 11.7%大环 结构, - 螺旋结构未检出;琥珀酰化修饰后, - 螺旋 结构形成, 百分含量为 12.4%, 其他二级结构均有所 降低,但降低幅度较小,可见酰化修饰对酪蛋白二 级结构影响程度较小,可能不会明显改变酪蛋白由 高级结构决定的功能特性。采用动态光散射和浊度 分析牦牛乳酪蛋白胶束粒径,结合扫描电镜观察发 现,酰化修饰使得牦牛乳酪蛋白胶束粒径减小,由 不规则的近球形转变为球形。荧光发射光谱研究表 明,琥珀酰化显著降低了牦牛乳酪蛋白的疏水性。 综上所述,琥珀酰化修饰使牦牛乳酪蛋白胶束 净负电荷增加, 胶束粒径减小, 二级结构发生变化, 降低了牦牛乳酪蛋白的疏水性,这必将致使酪蛋白 胶束的表面性质发生变化。 参考文献 1Li Haimei, Ma Ying, Dong Aijun, et al. 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Chemical modification is commonly applied to improve the functional properties of food proteins, such as acylation, succinylation, esterification, oxidation, reduction, glycosylation, phosphorylation, and alkylation. Succinylation is a useful method for significantly improving the functional properties of protein; iexhaustive succinylation induces large changes in physio- chemical properties of caseins, particularly in their electrostatic nature. However, very little literature is available about the structures, physio- chemical, and functional properties of yak caseins to direct industry processing of yak caseins. The present work tested the influence of succinylated modification on the structure and hydrophobicity of yak casein micelles. The spatial structure of modified and unmodified yak casein micelles were studied by Fourier transformation infrared spectroscopy. The diameter of modified and unmodified casein micelles was detected by dynamic light scattering and its surface morphology was observed by scanning electron microscope. The results showed that the spatial structure contents of - turn, irregular, - sheet, and large loop in yak casein micelles were 33.1%, 23.2%, 32.0%, and 11.7% respectively, while - helix was not detected. After succinylated modification, a certain amount of amino changed into the amide linkage, the charge of side chain changed from positive charge into negative charge, the repulsion between side chain groups decreased, and - helix was formed w

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