双相酸水解法提取薯蓣皂苷元的研究.pdf

5 6 7 【 8 9 1 9 91 ： 1 ： 43 I 水灾 ， 地f f f 全 胶 复脉汤 lj 人 ， 接豢m症 I( 11 卜板 fi t 液 凝 【l小 r J J J 质过 坂化 变化 的影州 二军 医大 ： 学报 ， 1 9 9 3 ；1 4 ( 1 ) ： 5 5 郧筱祥 畅 勇 ， 叶 剑峰 ， 等 东目 帅 胶的升 白作用及 饥 制研究 J f 1 现代应 药学杂志 ， 2 0 0 5， 2 2 ( 2 ) ： 1 0 2 王志海 ， f l IJ 秀 敏阿胶 补 皿作用 机理仞探 J 山东 中医 杂 志 ， 1 9 9 2 ， 1 1 ( 3 ) ： 3 5 郭成浩 ， 金毅阿 胶药 理作 用的 结f J 学 说 J 中 国中药 杂 志 ， 1 9 9 9， 2 4 ( 1 ) ： 5 4 1 y ffe l B， Mi h a , s c h MJ 1 mm ln 0 s u p 1他 s i Im a n d c a l 3 c e r ： t h c c i c l o s p o r i n c a s e J D r u g C h e m F o x i c o l ， 1 9 9 2；1 5 ( 2 ) ： 9 5 L u o J S，Ka mme r e r RMo du l a t io n s o f t h e e ff e c t o r f u n c t i o n a n d c y - t o k i n e pr od u c t i o n o f h u ma n l y mp h o c y t e s b y s e c r e t e d f a c t o r s de - v e d f r o m c o l o r e c t a l - c a r c in o m a c e l l s J 1 n t J C a n c e r ， 1 9 9 7， 7 2 ( 1 )：1 4 2 双相酸水解 法提取薯蓣皂苷 元的研究 l O 1 1 1 2 1 3 1 4 杨欢 ， 杨 克迪 ， 陈钧 ( 江苏大学生物与环境工 程学院， 江苏 镇江2 1 2 0 1 3 ) B u g g i GM i h ,j k o v i c I 】 Mi c r o e l l x i r O l t ln e l l|p r o d u c e d b y C 1 1 l e my e l o i d l e n k e n fi a c e l l s p r e v e n l s r c e l l a c l i v a l i o n a n d p r o l i f e r a ti o n b y i n h i b i t i ) f _、 - k a p t a B ， c - M y c ， a n d p R b p a t h w a y s J J I mm u l l o ， 2 0 01 ， 1 6 7 ( 1 0 ) ： 6 0 2 1 杨业金， 陈兆聪 白血病 细胞 产生 的免疫 抑制 因子对 1 1 2作 用的影响 J 癌症 ， 1 9 9 4， 1 3 ( 1 ) ： 4 K e l s o A， l r o u l l AB He t e r o g e n e r it y i n l y mp h o k i n e p r o f i l e s o f CD 4 + a n d CD8+ T c e l l s a n d c h ine s a c t i v a t e d i n v l v o a n d v i t r o J I m m u n o l R e v ， 1 9 9 1 ， 1 2 3 ： 8 5 S e d e r R A ，P a u l W E Ac q u i s it i o n o f ly mp h o k i n e - p r o du c i n g p h e - n o l y p e b y C D 4 - +T c e l l s J A n n u R e v l m m u n o l ， 1 9 9 4 。 1 2 ： 6 3 5 R o h r e r J W Co g g i n J M J r CD8 T c e l l c l o n e s i n h i b i t a n t l t u mo r T c e l l f u n c t i o n b y s e c r e t i n g I L - 1 0 J J l m m u n o l ， 1 9 9 5 ， 1 5 5 ( 1 2 ) ： 5 7 1 9 收稿 日期 ： 2 0 0 3 - 0 5 - 2 3 摘要： 目的建立双相酸水解法提取薯蓣皂苷元的最佳条件。方法 以薯蓣皂苷元得率为指标， 采用单 因素法建立双相酸水 解法从穿山龙中提取薯蓣皂苷元的最佳条件。结果按照穿山龙样品： 浓盐酸： 甲醇： 水： 石油醚( 1 0 ： 2 1 ： 6 0 ： 1 9 ： 1 0 0 ) 的比例加 入反应体系， 在沸水浴中加热回流提取 6 h ， 获得 比传统方法更高的得率。结论 双相酸水解法提取薯蓣皂苷元 简便 易行， 周 期短 ， 提取率 高。 关键词： 薯蓣皂苷元； 穿山龙； 双相酸水解法 中图分类号： T Q 4 6 7； R 9 7 7 1 文献标识码： A 文章编号： 1 0 0 7 - 7 6 9 3 ( 2 0 0 5 ) 0 4 - 0 2 7 0 - 0 3 Th e r e s e a r c h o n t wo ph a s e a c i d hy dr o l y s i s o f e x t r a c t i n g di o s g e ni n YAN G Hu a n，YANG K e d i ，C HE N J u n ( S c h o o l o f B i o l o g i c a l a n d E n v i r o n m e n t a l E n g i n e e r i n g， J i a n g s u U n i v e r s i t y ， Z h e n j i a n g 2 1 2 0 1 3 ， C h i n a ) ABS TRACT： OBJ ECT I VE T o e s t a b l i s h t h e o p t i mu m c o n d i t i o n s o f t wo p h a s e a c i d h y d r o l y s i s t o e x t r a c t d i o s g e n i n METHOD Us i n g s i n g l e f a c t o r me t h od ，w i t h t h e y i e l d o f d i o s g e n i n a s t h e i n d e x ，we e s t a b l i s h e d t h e o p t i mu m c o n d i t i o n s RES ULTS R h i z o ma Di o s c o r e a e n i p p o n i e a e e x t r a c t e d w i t h t w o p h a s e s y s t e m ( s a mp l e ： H C I ： M e O H： H 2 0 ： p e t r o l e u m e t h e r =1 0 ： 2 1 ： 6 0 ： 1 9 ： 1 0 0 )u n d e r t h e b o i l i n g wa t e r b a t h f o r 6h co u l d g e t h i g he r r e c o v er y o f di o s g e ni n t h a n t h a t o f t r a d i t i o n a l me t h o ds CONCLUS I ON T h i s me t h od i s c o n v e n l e n t ，t i me s a v i ng a n d h i g h e r KEY W ORD ： d i o s g e n i n；Rh i z o ma Di o s c o r e a e n i p p o n i e a e ；t w o p h as e a c i d h y d r o l y s i s 薯蓣皂苷元( d i o s g e n i n ) 是合成甾体激素的主要中间体 原料 ， 传统提取方法分为两种， 一种是先提取出薯蓣皂苷， 再 用酸水解皂苷， 最后萃取出苷元 。另一种是将植物置于 酸液中反应 ， 再提取干燥后 的滤 渣 “ 。这两 种方法操 作复 杂 ， 周期长 ， 提取率低 。 R o z a n s k i 用盐酸与二甲苯的混合体系对薯蓣皂苷元提 取工艺进行简化， 利用皂苷极性大， 易溶于极性溶剂， 而苷元 2 7 0 Ch i n J MAP ，2 0 0 5 u g u s t ， V o 1 2 2 N o 4 易溶于非极性溶剂的性质， 使水解获得的薯蓣皂苷元快速地 由水相转移至二甲苯相， 减 少了不 良反应的发生 ， 此后， We i s s e n b e r g 将该法用于提取甾体生物碱。笔者以穿山龙 为原料， 对反应温度、 酸和甲醇的浓度、 反应时间等因素进行 了考察， 并与传统方法相比较。 1 仪器与材料 B t i e h i R o t a v a p o r R - 2 0 0 型旋 转 蒸 发 器 ( 瑞 士 B t i e h i 公 中国现代应用药学杂志2 0 0 5 年 8 月第2 2卷第4期 维普资讯 司) ， U V 一 2 1 0 2 P C S型紫 外 f 见分 光光 度 汁 ( U N I ( L )公刊 ) 薯蓣皂苷 元标 准品 ( 美 同 S i g ma公 司) 浓盐 酸 、 无 水 甲醇 、 无水 乙醇 、 石油醚 ( 9 01 2 ( ) ： ) 、 醋酸 乙酯 、 高氯酸 均 为 分析 纯 ； 双蒸水 ， 试验室 自制 穿山龙， 当年生 ， 采于吉林省， 经欧阳臻高级工程师鉴定 为 D i o s c o r e a n ip p o n i c a Ma k i n o的根茎， 烘干后粉碎过3 6目筛， 备用。 2实验方法 2 1 双相酸水解法 准确称取 1 0 0 0 g样品置于圆底烧瓶中 ， 加人 1 0 0 mL含 一 定浓度盐酸的 甲醇水溶液 和 1 0 0 m L石油醚 ， 沸水浴 中加 热 回流提取一定 时间 。反 应完毕 后 ， 过滤反应 物 ， 滤液 收集 于 分液漏斗中， 静置分层， 收集上层液， 下层再用石油醚萃取 ， 至萃取液用 T L C检测 ， 无薯蓣皂苷元特征点。合并石油醚 液， 回收至干， 无水乙醇定容后测定薯蓣皂苷元得率。 2 2 传统 1法 准确称取样 品 1 0 0 0 g ， 置索 氏提取器 中。 用 无水 甲醇 提 取 8 h ， 回收 甲醇至干 ， 加 人 2 0 m o L L的硫酸溶 液 1 0 0 mL ， 沸水浴中加热 回流 水解 4 h ， 倾 出 ， 冷却 后 用石 油醚 萃取 多 次， 至萃取液用 T L C检测， 无薯蓣皂苷元特征点。合并萃取 液 ， 回收至干 ， 无水 乙醇 定容 ， 待测 。 2 3 传统 2法 准确 称取 样品 1 0 0 0 g ， 置 圆底烧 瓶 中， 加 入 2 0 m o l L 的硫酸溶液 8 0 mL ， 沸水浴 中加热 回流水解 4 h ， 倾 出 ， 用饱和 石灰水中和， 真空抽滤 ， 蒸馏水洗涤滤渣三次， 8 0 C干燥后。 用滤纸包裹滤渣， 置索氏提取器中， 在提取器底部烧瓶中加 入 2 0 0 m L石油醚 ， 水浴 9 0 C加热回流 8 h ， 回收石油醚至干 ， 无水乙醇定容， 待测。 3实验结 果 3 1 标准曲线的绘制 准确称取薯蓣皂苷元标准品4 2 0 m g ， 无水乙醇定容至 2 5 m L ， 作为0 1 6 8 m e- mL标准品溶液。准确吸取0 1 ， 0 2 ， 0 3 ， 0 4， 0 5 ， 0 6 ， 0 7 m L溶液， 挥干溶剂， 加人 5 m L高氯 酸， 置 2 5 ：E水浴保温2 5 m i n ， 以高氯酸为空白， 在 4 1 0 n m处 测定 吸 光 度 ， 得 回 归 方 程 A =9 7 6 6 2 X +0 0 0 2 9 ， r： 0 9 9 9 4， 薯蓣皂苷元含量在 3 3 6 2 3 5 2 tx g mL内， 与吸光 度呈良好线性关系 j 。 3 2 最佳提取条件的确定 3 2 1 酸 的选择一般来 说 ， 无 氧化性 酸的催化水 解效 果 好于氧化性酸( 如磷酸、 硝酸) ， 国内外文献报道常采用盐 酸或硫酸 ， 本 实验采用盐 酸作 为催化剂。 3 2 2 有机溶剂的选择 双相酸水解法提取薯蓣皂苷元必 须选择合适的轻相和重相溶剂 ， 它 要求重相溶剂可 以最大 程 度地从药材中提取薯蓣皂苷类化合物， 并使得反应达到一定 的温度， 以实现薯蓣皂苷的提取和水解完全； 同时， 对于薯蓣 皂苷元， 轻相溶剂与重相溶剂应有较大的分配系数 ， 保证其 转移完全。薯蓣皂苷类化合物易溶于含水的甲醇溶液 ， 工业 上常用石油醚 、 氯仿萃取薯蓣皂苷元 预实验中发现 ， 使 中闻现代应用药学杂志 2 0 0 5年 8门第 2 2卷第 4期 用 石油醚( 6 0 9 0 ) 作 为苹 取 相 ， 则水 浴温 度较高 时 反应 过 程中产生的泡沫时 常 冲出冷凝 管 ， 导致 反应 中断 ， 且 反直 体 系温度不易提高 ， 不利于薯蓣皂苷 元的提 取 。换用 石油醚 ( 9 01 2 0 ) 后 ， 没有 出现上述 现象。因此 ， 本 实验 采用 了含 水甲醇和石油醚( 9 0一l 2 0 ) 混合体系提取薯蓣皂苷元。 3 2 3 酸的浓度作为催化剂， 盐酸浓度对于水解效果影 响很大。本实验 比较 了含约 1 ， 2 ， 2 5 ， 3 ， 4 ， 5 ， 6 m o l L等不同 盐 酸浓度的 6 0 甲醇水 溶液 在沸 水浴 下 反应 5 h的水 解效 果。1 2 5 m o l L时薯蓣皂苷元得率变化明显， 2 5 m o l L 时效果最佳， 5 6 m o l L时， 药材已炭化。故盐酸浓度控制 在约 2 5 mo l L 。 见图 l 。 i 莲； j 0 8 0 6 0 4 。 2 l 2 3 4 5 6 盐酸浓度 ( to o l L ) 图 1 盐酸的浓度对薯蓣皂苷元收率的影响 F i g 1 I n fl u e n c e o f h y d r o c h l o r i c a c i d c o n c e n t r a t i o n 3 2 4 甲醇浓度 甲醇浓度与薯蓣皂苷的提取效果及皂苷 的水解完全性密切相关 ， 合适的浓度可以最大程度地提取和 水解薯蓣皂苷并使皂苷元转移完全。实验 比较了含 7 5 ， 7 0 ， 6 0 ， 5 0 ， 4 0 ， 3 0 ， 2 0 甲醇 的 2 5 m o l L盐 酸溶 液在沸水浴下反应 5 h的提取效果， 结果发现， 甲醇浓度为 6 0 时， 得率最高。见图2 。 堇i ： 篷i ： 1 0 2 0 30 4 0 5 0 6 07 0 80 甲醇 浓度 图 2 甲醇浓度 对薯蓣皂苷元收率的影响 Fi g 2 I nfl u e nc e o f me t h a no l c o n c e n t r a t i o n 3 2 5反应温度根据文献报道， 温度越高越有利于薯蓣 皂苷元 的提 取。本实验 以反应 体 系浸入 的水 浴温 度表示 反 应 条件 ， 以含约 2 5 m o l L盐酸的 6 0 甲醇水溶液和石油 醚 为反应体系， 在不同温度下反应 5 h ， 结果表明沸水浴时效果 最 佳。见图 3 。 1 8 褂 恶 1 蓬 8 O 反应温 度 图 3 反 应温度 对薯蓣皂苷元 收率的影响 Fi g 3 I nfl u e n c e o f r e a c t i o n t e mp e r a t u r e Ch i n J MAP， 2 0 0 5 Au g u s t ， V o 1 2 2 No 4 2 7 1 维普资讯 3 2 6 反应时问 验 【 f 】 准 确你肌 1 0 0 0 g样品 ， ； ， 圳 J 【 1 人含 2 5 m o Vl 的 6 0 j 醇水溶液 f u 石油醚各 1 0 0 n 1 【 0号 祭 了沸水浴 下， _乏应 21 0 h薯 侦皂 计元的提 取效 果。结果表 明 ， 提取 6 h最佳 。 4 一 、 ， 胖 曲 2 ： 3 1 5 6 7 8 9 1 0 反应 时间 ( h) 图 4 反 应时间对薯蓣皂苷元收率的影响 Fi g 4 I n fl u e n c e o f r e a c t i o n t i me 确定最佳提取工艺为 ： 将 1 0 g穿山龙置于浓盐酸： 甲醇： 水： 石油醚( 2 1 ： 6 0 ： 1 9 ： 1 0 0 ， 体积比) 混合体系， 在沸水浴中加 热回流提取 6 h ， 过滤， 重相采用石油醚进行多次液 液萃取 ， 直至萃取完全。薯蓣皂苷元得率可达 1 6 2 9 。 3 3 精密度 按最佳提取工艺 条件 ， 对样 品进行 5次 测定 ， 薯 蓣皂 苷 元提取率( ) 分别为 1 6 1 3 ， 1 6 4 8 ， 1 6 0 9 ， 1 6 2 0 ， 1 6 5 4 ， 平 均提取率为 1 6 2 9 ， R S D为1 2 7 4 。 3 4 双相酸水解法与传统工艺的比较 用 双相酸水 解法 的最 佳提取 工艺 和传统提 取方法 进行 比较， 结果显示比传统方法有更高的得率， 精密度高， 重现性 好 。 表 1 传统方 法提取穿 山龙 e e 薯蓣皂苷元 的分析 结果 Ta b 1 Tr a d i t i o n a l me t h o d s f o r d i o s g e n i n e x t r a c t i o n 4 讨 论 双相酸水解法的提取条件温和， 工艺简单易行 ， 无需高 温高压设备 ， 生 产J 占 1 大 人缩 砸， 管 颅皂讣 厄提取 率 较 高 解决 目前我 囤警蓣 电前丸 I ： 艺 i斤 带 来的 能耗 高 、 周期 、 维护高温高压设备投资人 系列问题找到了一个新的 思路 ， 对可行性及工 艺参 数作 J ， J 步研究 ， 有 待开展 更 为细 致 的研究 ， 其大规模的工业 化应 用 也是今后 值得研究 和探索 的问题 。 参考文献 1 书建荣 ， 董汛重偻I 1 薯蓣 t 汁死 的反丰 1 离效液棚 乜i 涛测定 J 色i 抟， 1 9 9 9， 1 7 ( 5 )： 4 9 8 2 郑慧丽 , -一a - ( 1 f ， 戊竹 I j ： L叶枝 化酊利溥层 层折及j 薯蓣 皂甙元定量 J 上 海医科 大学学报 ， 1 9 9 5 ， 2 2 ( 1 )： 6 5 3 李忠琼 ， 博文 ， 林瑞 超 ， 等高效液 卡 Ij 色谱法测定 闭鞘姜属 3 种植物巾总薯蓣皂 苷元 的禽 髓 J 时珍 同 医囤药 ， 2 0 0 1 ， 1 2 ( 4 )： 3 1 2 4 赵景婵 ， 郭治安 ， 成小 飞 ， 等穿龙 薯蓣 中薯 蓣皂 苷元的高效 液相色谱法测定 J 药物 分析杂 志 ， 2 0 0 0 ， 2 0( 1 )： 2 7 5 王慕邹 ， 周 同惠薯蓣属植物 中薯 蓣皂 苷元 的定量 测定 J 药学学报 ， 1 9 6 4， 1 1 ( 4)： 2 3 5 6 R o z a n s k i A A s i mp l i fi e d m e t h o d o f e x t r a c t i o n o f d i o s g e n i n f r o m Di o s c o r e a t u b e r s a n d i t s d e t e r mi n a t i o n b y g a s l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y J A n a l y s t ， 1 9 7 2， 9 7 ( 1 6 1 )： 9 6 8 7 We i s s e n b e r g MI s o l a t i o n o f s o l aso d i n e a n d o t h e r s t e r o i d a l alk a 1 o i d s a n d s a p o g e n i n s b y d i r e c t h y d r o l y s i s e x t rac t i o n o f S o l a n u m p l a n t s o r g l y c o s i d e s t h e r e f r o m J P h y t o c h e m i s t r y ， 2 0 0 1 ， 5 8 ( 3 ) ： 5 01 8 王俊 薯蓣皂苷元的分离技术研究 D 镇江： 江苏大学生药 学研 究所 ， 2 0 0 3 ， 9 R o t h r o c k J W，H a m me s P A，Mc ale e r W J ， e t a 1 I s o l a t i o n o f d i o s g e n i n b y a c i d h y d r o l y s i s o f s a p o g e n i n J I n d E n g C h e m， 1 9 5 7 ， 4 9 ( 2 )： 1 8 6 1 O J o s (A C C E v a l u a t i o n o f edi b l e Y a ms o f D i o s c o r e a s p e c i e s as p o t e n t i a l s o u r c e s o