酸菜中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选.pdf

酸菜中高产 2氨基丁酸乳酸菌的筛选 蒋冬花1 , 2,后加衡1,黄大年2,任不凡2,毛建卫3 (1. 浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004 ;2.浙江新安化工集团有限公司,浙江 杭州 311600 ; 3.浙江科技学院 生物与化学工程系,浙江 杭州 310012) 摘 要 从酸菜中筛选到2株相对高产 2氨基丁酸的乳酸菌( GABA)菌株,酸菜1号和酸菜3号。酸菜1号 初步鉴定为植物乳杆菌(L actobacillus plantarum ) ; 酸菜3号初步鉴定为乳酸链球菌(Streptococcus lactis)。 实验还对酸菜1号菌株的培养基和培养条件进行了优化:用蔗糖为碳源、 蛋白胨和牛肉膏作为复合氮源、 培养 基初始p H为6. 0、 培养温度为3034 时该菌株发酵产GABA的量最多,发酵过程中的振荡培养(100 r/ min) 和静置培养对GABA的产量无明显影响;在最佳培养基组合和发酵条件下,发酵液中GABA含量可达 4 g/ L以上,表明利用乳酸菌进行富含GABA食品的生产是可行的。 关键词 2氨基丁酸( GABA) ;乳酸菌;分离;鉴定 中图分类号 Q939. 11 + 7 文献标识码 A 文章编号 1005 - 7021(2007)01 - 0035 - 05 Screening of 2 Amino2Butyric2Acid2High2Yielding Lacto2Bacteria in Pickled Vegetable J IANG Dong2hua1 ,2,HOU Jia2heng1,HUANG Da2nian2,REN Bu2fan2,MAO Jian2wei3 (1. Coll. of Chem.2.Xinan Chem. Ind. Group. Co. L TD.Hangzhou311600;3. Dept. of Biochem.Engin. Zejiang Univ. of Sci. lactic acid bacteria ; isolation; identification 2氨基丁酸( 2 amino butyric acid ,GABA)广 泛存在于自然界中,是一种非蛋白质组成的天然 氨基酸,主要存在于哺乳动物脑、 脊髓中,是一种 重要的抑制性神经传递物质。已有研究表明: GABA是一种生理活性成分,具有抗焦虑、 抗惊 厥、 降血压、 增加神经营养、 改善脑机能、 促进长期 记忆、 促进生长激素分泌、 活化肾功能、 肝功能等 多种生理功能1 ,2,有很好的医药应用前景;同时 又是一种新型食品活性因子,在功能食品中的应 用已成为研究热点3 ,4。近年来,富含GABA的 食品开发受到重视,目前也正致力于这方面的 研究。 GABA的制备有化学合成法和生物合成法。 化学合成法成本较高且安全性差,而生物合成法 则是一种低成本的方法。GABA的发酵法制备以 往用大肠杆菌作为菌种5,但是使用大肠杆菌存 收稿日期:2006 - 09 - 06 作者简介:蒋冬花 女,教授,博士后。主要从事微生物学和植物病理学教学与科研工作。 项目来源:中国博士后(2004036170)和浙江省博士后(20042bsh2 003) 科研资助项目 53微生物学杂志 2007年1月第27卷第1期 JOURNAL OF MICROBIOLOGYJan. 2007 Vol. 27 No. 1 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 在安全卫生方面的隐患。近期研究发现:一些高 安全的微生物,如曲霉6 ,8、 乳酸菌3 ,4 ,911、 酵母 菌12等也具有谷氨酸脱羧酶( Glutamate Decar2 boxylase ,简称GAD)活性,可以进行GAD的提 取和GABA的生产。本研究从食用级微生物乳 酸菌着手,通过菌种选育和发酵条件优化等研究 以获得高产GABA的菌株,确定最佳的培养发酵 条件,为使用这种食品安全级微生物进行GABA 的生产以及富含GABA的功能性食品的生产提 供菌种。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 菌种及其来源 本实验选用白菜、 酸奶、 藕片、 佛手果、 胡萝卜等为材料,28厌氧腌制 2 d至酸性 (p H 约4. 0) ,取汁液100L接入乳 酸菌分离培养基(含溴甲酚绿 ) , 无菌涂布器涂匀, 32 培养48 h ,出现圆形乳白或黄色菌落,周围 培养基变为黄色者初步确定为乳酸菌。经分离、 纯化后移入MRS13试管中,将所获菌株编号,置 4 冰箱中保存,备用。 1. 1. 2 培养基 乳酸菌分离培养基(质量分 数, %) :牛肉膏1 ,蛋白胨1 ,酵母膏1 ,葡萄糖 0. 5 ,番茄汁20 ,吐温0. 05 ,碳酸钙2 ,琼脂1. 5 ,溴 甲酚绿0. 01 , p H 6. 5 ;MRS培养基13(质量 分数, %) :酪蛋白胨1 ,牛肉提取物1 ,酵母提取物 0. 5 ,葡萄糖0. 5 ,乙酸钠0. 5 ,吐温280 0. 1 ,柠檬 酸二胺0. 2 ,磷酸氢二钾0. 2 ,硫酸镁0. 02 ,硫酸 锰0. 005 ,琼脂2. 0 ,p H 6. 5 ;TYG液体培养 基13(质量分数, %) :胰蛋白胨0. 5 ,酵母膏0. 5 , 葡萄糖1. 0 ,丁二酸钠0. 5 ,p H 6. 5。 1. 2 方法 1. 2. 1 乳酸菌菌株的鉴定 形态学鉴定:观 察、 记录分离培养基平板上菌落形态;菌体形态经 染色后用显微镜(Leica ,德国)于100倍的油镜下 观察并拍照14;生理生化特性鉴定:革兰氏染 色反应、 接触酶反应、H2S试验和糖发酵试验等 参考文献14进行。 1. 2. 2 菌种活化与传代 用MRS固体柱状培 养基进行菌种活化传代;32 培养24 h后置于 4 冰箱中待用,菌株每2周转接1次。 1. 2. 3 发酵种子培养 从活化的MRS固体斜 面培养基上挑取适量菌种接入液体MRS中, 32 活化培养16 h。250 mL三角瓶中装入 50 mL TYG培养液,取培养16 h的种子培养液, 按0. 2 %的接种量接种后,32静置培养24 h 作发酵种子。 1. 2. 4 发酵培养和产GABA菌株筛选 250 mL三角瓶中装入50 mL加入质量分数为 1 %谷氨酸钠的TYG液体培养基,取培养16 h 的种子培养液,按3 %接种量接种,32静置培 养24 h后,取发酵液分析检测GABA产生情况, 进行菌株筛选。 1. 2. 5 发酵液中GABA的定性、 定量测定 用 改良纸层析法13,按0. 4 %的比例将显色剂茚三 酮加入展开剂中,展开剂组成体积比为正丁醇 冰醋酸 水= 421 ,取发酵液1 000L于离 心管中,煮沸5 min后10 000 g离心10 min ,取 5L上清液点样,展开后65显色30 min ,拍 照。标准 2氨基丁酸(Sigma ,纯度99. 9 %以上) 配成5 g/ L做参比,将显色后的条带剪下,用 5 mL洗脱剂洗脱,在520 nm测吸光度进行初步 定量。洗脱剂组成的质量分数比为0. 1 %硫酸铜 75 %乙醇= 238。 2 结果与分析 2. 1 乳酸菌的分离与纯化 通过分离、 纯化和初步鉴定共获得74株乳 酸菌菌株。 2. 2 产GABA乳酸菌菌株的初筛 将各菌株接入TYG培养液发酵培养24 h , 发酵液用改良纸层析法分析检测13。测定结果 表明(见表1) ,不同乳酸菌产生GABA的能力存 在显著差异,能产生GABA的菌株有酸菜中分离 的18号、10号、18号、2027号、32号、35 号、36号;酸奶中分离的1号、2号和11号;藕 片中分离的2号、 佛手果中分离的1号和胡萝卜 中分离的1号。 2. 3 菌种复筛 对所获产生GABA较明显乳酸菌菌株进行 第2次纸层析检测,并用分光光度计进行初步定 量,以筛选GABA含量相对较高的菌株。结果 GABA含量较高的有酸菜1号、3号、 酸奶11号 等(图1) ,GABA含量分别为3. 82、3. 55和2. 34 63 微 生 物 学 杂 志 27卷 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. g/ L ( 图 2) 。下面以酸菜1号和酸菜3号为研究 对象进行菌种鉴定。 表1 不同乳酸菌菌株发酵液中GABA的产生 Table 1 GABA production of lactic acid bacteria in fermentation medium 分离材料酸菜酸奶藕片佛手果 胡萝卜 测试菌株号136120161616 产GABA 1、2、3、4、5、6、7、81、2、11211 菌株号 10、18、20、21、22 23、24、25、26、27 32、35、36 图1 酸菜1号、3号和酸奶11号培养液中 GABA产生的层析结果 Fig.1 The GABA production chromatographic separations result of three selected lactic acid bacteria 加样量:GABA为1L ,样品为5L The quantity of GABA is 1L ,and the specimen is 5L 图2 酸菜1号、3号、 酸奶11号培养液中GABA含量 Fig. 2 The GABA productions of three selected lactic acid bacteria in fermentation medium 2. 4 菌种鉴定 2. 4. 1 形态特征 酸菜1号:菌落较小、 圆 形、 中间隆起,表面湿润光滑,色泽乳白较暗,边缘 不规则。杆状,较细长,长短不一,两头稍平,有的 细长弯曲,无芽胞(图 3A) 。 酸菜3号:菌落较 小、 圆形、 中间隆起,表面湿润光滑,乳白色,边缘 整齐,周边有小皱纹。球状,多成对或串连呈长链 状,无芽胞(图 3B) 。 2. 4. 2 生理生化特征 酸菜1号:革兰氏G+, 不液化明胶;吲哚反应阴性,硫化氢试验阴性,接 触酶试验阴性。葡萄糖发酵产酸不产气,果糖、 麦 芽糖、 甘露糖、 蔗糖等发酵阳性。 根据形态特征和生理生化反应,此菌株可初 步鉴定为乳杆菌属,植物乳杆菌(L actobacillus plantarum) 14 。 酸菜3号:革兰氏G+,不液化明胶;吲哚反 应阴性,硫化氢试验阴性,接触酶试验阴性。葡萄 糖发酵产酸不产气,果糖、 麦芽糖、 甘露糖、 蔗糖等 发酵阳性。 根据形态特征和生理生化反应,此菌株可初 步鉴定为乳酸链球菌属,乳酸链球菌(Streptococ2 cus lactis) 14 。 2. 5 培养基和培养条件的优化(酸菜1号) 2. 5. 1 不同碳源对GABA产量的影响 以 TYG培养基为基础,分别采用葡萄糖、 乳糖、 可溶 性淀粉、 蔗糖、 谷氨酸钠作为惟一碳源,考察不同 碳源对发酵产生GABA量的影响。实验结果(表 2) 表明,蔗糖和谷氨酸钠作为碳源时发酵液中 GABA产量相对较高,其他3种碳源则较低,并 且效果基本一致,考虑到使用蔗糖的成本要比谷 氨酸钠低,下面实验采用蔗糖作为主要碳源。 表2 不同碳源对发酵液中GABA产量的影响 Table 2 Effects of different carbon sources on GABA production 碳源蔗糖谷氨酸钠 可溶性淀粉 乳糖葡萄糖 GABA平均4. 023. 853. 223. 183. 06 含量/ (gL - 1) 差异显著性a , Aa , Ab , Bb , Bb , B (0. 05 , 0. 01) 注:差异显著性经Duncan氏新复极差法检验,不同小写字母 表示在P0. 05水平上差异显著,不同大写字母表示在P0.01 水平上差异显著,下同 731期 蒋冬花等:酸菜中高产 2氨基丁酸乳酸菌的筛选 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 图3 酸菜1号( A)和酸菜3号( B)形态特征(1 000) Fig. 3 The shapes in microscope of NO1 and NO3 from picking vegetable(1 000) 2. 5. 2 不同氮源对GABA产量的影响 在以蔗 糖作为碳源的基础上,分别采用不同的有机氮和 无机氮作为惟一氮源进行实验,结果见表3。以 无机氮硫酸铵和硝酸钠作为氮源时, GABA生成 的量非常少,有机氮则对发酵产GABA的效果较 显著,其中又以蛋白胨的效果最好,可以达到无机 氮的34倍。 表3 不同惟一氮源对发酵液中GABA产量的影响 Table 3 Effects of different nitrogen sources on GABA production 氮源蛋白胨酵母膏牛肉膏硫酸铵硝酸钠 GABA含4. 053. 522. 731. 161. 03 量/ (gL - 1) 差异显著性a , Ab , Bc , Cd , Dd , D (0. 05 , 0. 01) 因为蛋白胨对发酵产GABA的效果最好,组 成复合氮源时都加入蛋白胨。以蛋白胨分别和酵 母膏、 牛肉膏、 硝酸钠和硫酸铵组成复合氮源。不 同复合氮源对发酵产GABA的影响见表4。结 果表明使用蛋白胨和牛肉膏作为复合氮源时发酵 液中GABA的含量最高,可能是这两种物质含乳 酸菌生长所需的各种辅助因子较丰富,并相互补 充,激活了GAD酶的活性,从而使发酵液中GA2 BA的含量升高。两种有机氮组合比有机氮与无 机氮组合效果好。 2. 5. 3 初始p H对GABA产量的影响 将优化 后的培养基即用蔗糖为碳源,以蛋白胨和牛肉膏 为复合氮源的培养基,用1 mol/ L的NaOH和 1 mol/ L的HCl溶液调节使初始p H分别为 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0 ,然后接入菌种在32 进行摇 床培养,24 h后测定发酵液中GABA的含量,结 果表明(表5) ,培养基初始p H以6. 0为宜,此时 发酵液中GABA的含量最高。 表4 不同复合氮源对发酵液中GABA产量的影响 Table 4 Effects of different compound nitrogen sources on GABA production 氮源蛋白胨+蛋白胨+蛋白胨+蛋白胨+ 牛肉膏酵母膏硝酸钠硫酸铵 GABA含量4. 213. 562. 942. 48 / (gL - 1) 差异显著性a , Ab , Bc , Cc , C (0. 05 , 0. 01) 表5 初始pH对发酵液中GABA产量的影响 Table 5 Effects of original pH on GABA production pH6. 07. 05. 04. 0 GABA含量/ (gL - 1) 4. 283. 363. 182. 6 差异显著性(0. 05 , 0. 01)a , Ab , Bb , Bc , C 2. 5. 4 培养温度对GABA产量的影响 将经优 化的液体发酵培养基接入菌种,分别在28 36 不同的温度下培养24 h测定发酵液中GA2 BA的含量。结果显示,当温度为3034 时发 酵产GABA的量较高,表明在此温度范围内 GAD酶活性较高,温度偏高或偏低对酶活性表现 都不利。 83 微 生 物 学 杂 志 27卷 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 表6 培养温度对GABA产量的影响 Table 6 Effects of culture temperature on GABA production 培养温度/2830323436 GABA含量/ (gL - 1) 3. 754. 244. 294. 123. 67 差异显著性(0. 05 , 0. 01)a , Ab , Bb , Bb , Ba , A 2. 5. 5 振荡培养和静置对GABA产量的影响 将优化后的培养基接入菌种分别进行振荡培养 (100 r/ min)和静置培养。结果表明,振荡培养和 静置培养后发酵液中GABA的产量接近,静置培 养为4. 26 g/ L ,振荡培养为4. 29 g/ L ,没有显著 差异。可能因为乳酸菌本身是兼性厌氧菌,氧气 的多少对发酵产生GABA的量和菌体的生长影 响不大。 3 讨 论 本实验的目的是筛选具有高谷氨酸脱羧酶活 性的乳酸菌,发酵制备GABA和开发富含GABA 的食品。通过筛选,从酸菜中获得了2株相对高 产GABA的乳酸菌。通过培养基和发酵条件优 化,酸菜1号最佳的培养基组合和适宜培养条件 为:蔗糖作碳源,蛋白胨和牛肉膏作复合氮源的 TYG培养基,初始p H为6. 0 ,发酵温度为30 34 时,较适于GABA的生成,此时发酵液中 GABA含量可达4 g/ L以上;振荡培养(100 r/ min)和静置培养对 GABA的产生影响不大。 利用微生物发酵生产GABA是一种安全,低 成本的方法。乳酸菌在食品工业中属食品级微生 物,基本上不存在安全卫生方面的问题3 ,4 ,911。 因此,可以利用筛选出的乳酸菌进行富含GABA 功能因子食品的研究与开发及GABA的制备。 目前日本在研究开发富含GABA食品方面所做 的工作最多2 ,6 ,9 ,12,已开发成功的产品有GABA (Gabaron)茶、GABA的米胚芽、 发芽糙米等。我 国从食品原料中富集GABA技术的研究还刚刚 起步,强化GABA的许多制品还只是一种构想, 需做大量的研究工作13。利用微生物自然资源, 分离筛选新功能的乳酸菌菌株,生产GABA功能 性食品配料,也是一种新的尝试。 参考文献: 1 Guin T W C , Bottiglieri T , Carter S I. GABA , 2 hydroxy2 butyric acid , and neurological disease J . Ann. Neurol. , 2003 , 6 :3212. 2 Lin Z, Saito H , Omori M ,et al. Effect of gabaron tea on the blood pressure and kidney function of rats loaded with saline J . Nippon Kaseigaku Kaishi , 2000 , 51 (4) : 2652 271. 3 Park KB , Oh S H. Production and characterization of GA2 BA rice yogurt J . J. Food Sci. Biotechnol. ,2005 , 14 : 5182522. 4 Park K B , Oh S H. Cloning and expression of a full2length glutamate decarboxylase gene fromL actobacillus planta2 rumJ . J. Food Sci. Nutri. , 2004 , 9 :3242329. 5 Maras B , Sweeney G, Barra D ,et al. The amino acid se2 quence of glutamate decarboxylase fromEscherichia coli J . Eur. J. Biochem. , 1992 , 204 : 93298. 6 Kato Y, Kato Y, Furukawa K,et al. Cloning and nucleo2 tide sequence of the glutamate decarboxylase encoding gene gadA fromAspergillus oryzaeJ .Biosci. Biotechnol. Bio2 chem. , 2002 , 66 : 2 60022 605. 7 Su Y C , Wang J J , Lin T T ,et al. 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