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文档简介

聚合酶链反应（PCR）,聚合酶链（PCR）技术,PCR反应体系,PCR技术过程及原理,.,聚合酶链反应技术,聚合酶链反应（PCR）技术是一个能在试管内模仿细胞内核酸复制过程，也就是能在体外特异地扩增一段特定核酸序列的技术,.,PCR的反应体系,参与PCR反应的成分：,模板,引物,dNTP,Taq DNA聚合酶,Mg2+,缓冲液,.,模板：即为要被复制的核酸片段 条件：需要较高的纯度,.,引物：化学合成的寡核苷酸 条件： 1.一般长度为20个核苷酸 2.两条引物的序列不能互补 3.两条引物之间的Tm值不能相差太多,.,dNTP:4种核苷酸 条件：4种核苷酸的浓度需要一致，否则容易出现DNA聚合酶错配的概率,.,Taq DNA聚合酶：是从水栖嗜热菌中提取的一种酶，能催化DNA合成。具有5端3端的外切酶活性。,.,Mg2+：是Taq DNA聚合酶的辅助因子，可以稳定其活性,.,缓冲液：在扩增过程中使PH值维持在7.2左右，使DNA聚合酶发挥最大的活性,.,PCR技术基本过程,变性 退火 延伸,.,变性,在熔点温度的条件下（94左右），使双链DNA结构的氢键断裂，形成两条单链分子作为扩增反应的模板，以便与引物结合。 94 DNA双链解开,.,退火,将反应体系温度将至熔点温度以下（4070），以便使引物与模板DNA序列互补，形成杂交链。 4070 引物与DNA模板杂交,.,延伸,将反应体系的温度升至72，此时反应体系按照模板链的序列以碱基互补配对的原则一次把dNTP加至引物的3端，在Taq DNA聚合酶的作用下，杂交链不断延伸，直至形成新的DNA双链。新的DNA又可以作为下一个模板进行扩增，如此反复循环，可以到达数十万倍到百万倍的扩增数 72 4种dNTP在引物和DNA聚合酶的 的作用下延伸,.,定量PCR技术,指在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,.,Taqman荧光探针： 5端荧光基团 FAM 3端淬灭基团,.,PCR扩增时，Taq酶的5- 3外切酶活性将探针酶切降解，使探针上的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团在激发光作用下发出荧光； 每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,16,.,荧光阈值,在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)。,阈值线,实时定量PCR的两个重要概念,17,.,Ct值(cycle threshold)的概念,指PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数。它与起始拷贝数的对数成线性关系（即与起始拷贝数反比关系）,阈值线,18,.,方法学评价： 优
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