课件：食物中毒的判别及检验.ppt

食物中毒案例,PPT制作：,PPT讲解：,PPT整理：,案例回顾,B市C镇初级中学为政府公办初级中学，共有学生1132名，22个班级，83名老师，7名食堂工作人员。其中寄宿生630名，走读生502名，周一至周五上课，周六至周日放假。根据学校报告，6月5日下午17：20开始，有学生出现腹痛、腹泻、呕吐、恶心和头痛、头昏等症状，到6月6日晨检发现有80余名左右出现同类症状，因这些学生在学校有共同就餐史，且发病时间非常集中，怀疑为食物中毒。6月6日上午7：30学校向C镇卫生院报告并组织患病学生就诊。(其他的详细信息见教案),非细菌性食物中毒,初步筛查（直接涂片，呕吐物、粪便）,分离培养,平板分离,快速检验（PCR）,全面生化检验、血清学检验,血常规,粪常规以及粪便、呕吐物病原学检验,血清学鉴定,检验流程图,增菌培养,细菌性食物中毒,判断为什么类型的中毒事件,食物中毒相关概念,食物中毒：摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或者把有害物质当作食品摄入后出现的非传染性(不属于传染病)的急性、亚急性疾病。 食物中毒诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行的 食物中毒可分为细菌性和非细菌性食物中毒,细菌性食源性疾病,细菌性食源性疾病：是进食被细菌或细菌毒素污染的食物而引起的感染性或中毒性疾病。 细菌性肠道传染病（霍乱、痢疾、伤寒副伤寒等） 短期内集中发病常被诊断为细菌性食物中毒 散发或潜伏期较长病例常被诊断为胃肠炎或其他疾病,细菌性与非细菌性食物中毒区别,细菌性食物中毒的特点,与饮食有密切关系，去除原因食品后，不再有新的患者。 临床症状以急性胃肠炎为主，基本相同。 短时期内多人发病，无人传染人的现象。 中毒发生与不同区域人群饮食习惯有密切关系。 与季节相关。细菌繁殖条件及人体防御机能。 发病率高，病死率较低、恢复快、多数预后良好,细菌性食源性疾病的流行病学,传染源：被病原菌感染的动物或人 传播途径：通过进食被细菌或其毒素污染的食物 人群易感性：普遍，无病后免疫力，可重复感染 流行特征：夏秋季高发；病例可散发或爆发流行；发病急，时间集中，潜伏期短；有共同进餐史；症状轻重与进食量有关。,细菌性食物中毒还是病毒性食物中毒？,细菌性食物中毒：WBC增加，中性粒细胞增加； 病毒性食物中毒：淋巴细胞和单核细胞增高,根据流病资料、病例的三间分布，与患者临床表现、病患血常规检查结果： 1.病患有共同进餐史； 2.病例潜伏期最短为5小时，最长为47小时。中位数为13小时，具有明显的时间聚集性； 3.案例皆来自于学校，具有地点聚集性； 4.呕吐或24h内腹泻3次及以上，恶心、腹痛、（典型的胃肠炎临床症状）发热等临床症状； 5.病患血常规检测共收集了140人的血常规结果，白细胞升高占28%，中性粒细胞升高占61%。部分病例碱性磷酸酶升高。 判断为细菌性食物中毒。,由于患者主要临床表现为头痛头晕、腹痛、腹泻（黄色水样便）、呕吐、恶心、乏力等症状，部分病例低热等，初步怀疑为患者感染的可疑菌可能为以下几种。,细菌性食物中毒实验室应急检测程序,初步筛查 直接涂片检查 分离培养检验 1.增菌培养、平板分离培养 2.快速检验（PCR） 3.全面生化检验与血清学检验,直接涂片 取新鲜病患的粪便标本涂片，空气自然干燥后火焰上加热固定，革兰氏染色镜检。 若镜检有鱼群状排列弧菌，可怀疑为霍乱弧菌。,增菌培养 需氧菌增菌培养基 7.5% NaCl肉汤 金黄色葡萄球菌 葡萄糖肉浸液肉汤 溶血性链球菌 TTB、SC增菌液 沙门氏菌 志贺氏菌增菌液 志贺氏菌 3.5% NaCl APW 副溶血性弧菌 肠道菌增菌液 EC 病原性大肠埃希氏菌 厌氧菌增菌 庖肉培养基 产气荚膜梭菌、肉毒梭菌,直接平板培养 将处理后的检样直接接种于各种平板培养基上 需氧培养 普通琼脂平板 蜡样芽孢杆菌及其他未知菌 血平板 葡萄球菌、链球菌、蜡样芽孢杆菌 伊红美蓝培养基 大肠埃希氏菌、变形杆菌 麦康凯培养基 大肠埃希氏菌、变形杆菌 HE、SS培养基 沙门氏菌、志贺氏菌 TCBS培养基 副溶血性弧菌 厌氧培养 葡萄糖血琼脂平板 产气荚膜梭菌、肉毒梭菌 CCDA 空肠弯曲菌,快速检测：PCR,用上述方法培养的增菌液1mL,8000r/min离心5min,50LDNA提取液,1.5mL无菌离心管,12000r/min离心5min,吸弃上清液,沸水浴5min,取上清液保存于-20备用以待检测，-70可长期保存,PCR扩增 细菌模板DNA提取,2019/8/25,21,可编辑,PCR扩增,1.设置对照,PCR扩增,2.反应体系 根据不同待测菌选择相对应引物与反应参数,PCR扩增,扩增产物电泳检测 1.用电泳缓冲液制备1.8%-2%琼脂糖凝胶，55-60时加入溴化乙锭至终浓度为0.5g/mL 2.取8-15LPCR扩增产物，分别与2L上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照。 3.3V/cm-5V/cm恒压电泳20-40min后用凝胶成像分析系统记录保存。,PCR结果判定,若阴性对照与空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品未出现相应大小扩增条带，则报告为检验结果阴性。 若待测样品出现相应大小扩增条带可判定结果为假定阳性，此时用传统检测步骤进行确认，最终结果以后者检测结果为准。,传统手工鉴定,1.分离 分别用接种环取上述沙门菌增菌液1 环，划线接种于一个BS 琼脂平板和一个XLD 琼脂平板（或HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。XLD 琼脂平板、HE 琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板于36 1 分别培养18 h24，BS 琼脂平板培养40 h48 h 。观察平板上的菌落特征。,传统手工鉴定,2.生化反应 2.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h。观察菌落特征。,初步生化:三糖铁（TSI）,传统手工鉴定,2.2、接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试验）、尿素琼脂 （pH7.2）、氰化钾 （KCN） 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h，按下表判定结果。 将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24 h，以备必要时复查。,传统手工鉴定,2.3 初步生化结果判定 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项中有1项异常，按表4 可判定为沙门氏菌。 如有2 项异常为非沙门氏菌。,传统手工鉴定,2.3初步生化结果判定 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 反应序号A3：补做ONPG*。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 （*：邻硝基酚-D-半乳糖苷溶液试验：将待检培养物接种3%氯化钠三糖铁琼脂， 36 1 培养18 h。挑取1 满环新鲜培养物接种于0.25 mL 3%氯化钠溶液，在通风橱中，滴加1 滴甲苯，摇匀后置37 水浴5 min。加0.25 mL ONPG 溶液，36 1 培养观察24 h。阳性结果呈黄色。阴性结果则24 h 不变色。）,传统手工鉴定,3.血清学鉴定 3.1多价菌体抗原（O）与多价鞭毛抗原（H）鉴定 在玻片上划出2 个约1 cm2 cm 的区域，挑取1 环待测菌，各放1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1 滴多价菌体（O）抗血清或多价鞭毛（H）抗血清，在另一区域下部加入1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。,传统手工鉴定,3.2血清学分型 用抗血清对所分离菌种的菌体O抗原、表面Vi抗原、第I相和第II相H抗原进行凝集试验 用AF 多价O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。 多价抗血清凝集后再用分别代表每个O血清群的单价因子血清定群。再按照确定的O群，分别用H因子血清检测第I相和第II相H抗原，综合O、H以及Vi因子血清检查结果，判断沙门氏菌的血清型。,关于收集到的病患的检验,一：粪便 粪便常规：病患粪便标本：在接收到的病患粪便标本之后，进行粪便常规检查，并且对其增菌培养后进行病原学检查 目的：粪便常规检查是为了查看WBC、RBC,有无隐血，是否为侵袭性的。在显微检查的时候也可看有无可疑虫卵或可疑菌（若为霍乱弧菌则可在图片上看到逗号状鱼群样排列的菌群）；做增菌分离培养是为了做病原学检查，看有无沙门菌、志贺菌、蜡样芽孢杆菌等（实验室内细菌的常规检查）。,二：病患的呕吐物标本,呕吐物常规检查：接收到标本后做涂片检查、隐血实验和增菌分离培养 目的：涂片检查是为了检查有无可疑虫卵，隐血实验是为了检查是否有上消化道出血。,1.血清学实验：将病人急性期（病人刚进医院未接受任何治疗时）和恢复期（治疗一周之后）的血清与所分离的病原菌做抗原和鞭毛试管凝集试验，如恢复期血清凝集效价较发病初期有4倍以上升高，则有诊断价值。 2.血常规：检查病患血液中的RBC、WBC、Hb、PLT数量形态等血象变化，结合粪便标本、呕吐物标本检查结果、患者临床症状判断此次中毒事件是细菌性还是病毒性。,三：病人血液标本,溯源具体流程,将食堂工作人员有关标本、患者共同食用食物标本、食堂用水做一个沙门氏菌的快速试剂盒检测，测出哪个标本有沙门氏菌，再做系统生化和血清学检验，如果结果与前面检测出的沙门氏菌型相同，则可进行进一步溯源。查购买商和产地进行调查，最终找出源头，销毁源头，预防下次再出现此类事件。,沙门氏菌快速检验,试剂盒法 该试剂盒基于酶联免疫检测原理，沙门氏菌的单克隆抗体包被在微孔内。分析过程中，如果样品中有沙门氏菌存在，当加入样品时，即