课件：蛋白质的共价结构.ppt

第4章 蛋白质的共价结构 （一级结构）,1878年，恩格斯在反杜林论中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分不断的自我更新。” 细胞内原生质是生命现象的物质基础，蛋白质和核酸是构成原生质的主要成份。,一、蛋白质通论,（一）蛋白质的化学组成和分类 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他 微 量,蛋白质的含氮量,氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量： 蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数 6.25,蛋白质的分类,一、按化学组成分 1、单纯蛋白：只含蛋白成分 2、缀合蛋白：蛋白+辅基 二、按功能分,单纯蛋白,又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。 1，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 2，谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。 3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,缀合蛋白,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。 1、色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 2、糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 3、脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-，-脂蛋白等。 4、核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。,1. 酶类, 占细胞内蛋白质种类的绝大部分 2. 运输蛋白, 如albumin, hemoglobin, transferrin等 3. 收缩运动蛋白, 如actin, myosin, tubolin等 4. 激素蛋白, 如insulin, growth hormone等 5. 细胞激动素(cytokinin), 如EGF, PDGF, IL-2等 6. 受体蛋白, 如insulin receptor, rhodopsin等 7. 毒素蛋白, 如cholera toxin, ricin, pertussis t. 8. 营养贮藏蛋白, 如prolamine, glutelin等 9. 防御蛋白, 如IgG等 10.结构蛋白, 如keratin, collagen等,按功能的蛋白质分类法,按功能的蛋白质分类,（二）蛋白质的形状和大小,按形状和溶解度可将蛋白质分为： 1、纤维蛋白 2、球状蛋白 3、膜蛋白 四、按肽链构成分 1、单体蛋白 2、寡聚蛋白或多聚蛋白,蛋白质的大小,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。,primary structure 一级结构：多肽链的氨基酸序列 secondary structure 二级结构：多肽链借助氢键排列成的有规则螺旋，折叠 tertiary structure 三级结构：多肽链借助各种非共价键折叠成的紧密球状构象 quanternary structure 四级结构：寡聚蛋白质中各亚基在空间上的相互关系和结合方式 示意图如下：,（三）蛋白质的结构层次,蛋白质结构层次,二、肽 （一）肽和肽键结构,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 命名：某氨基酰某氨基酰某氨基酸 或某某肽 有时两端会连接成环状态,肽键,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面，肽键是指构成这一平面的-CO-NH-。,肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。,肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连,肽键与氨基酸,四肽的结构,（三）天然存在的活性肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。其中很多作为激素发挥作用。 如：谷胱甘肽（P168）；脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；蛇毒多肽。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,三、蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括： 1、组成蛋白质的多肽链数目. 2、多肽链的氨基酸顺序， 3、多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,测定蛋白质的一级结构的基本要求： 1，样品必需纯（97%以上）； 2，知道蛋白质的相对分子量。,（一）蛋白质测序的策略,蛋白质一级结构测定的步骤,1、测定蛋白质多肽链数目 2、拆分蛋白质分子多肽链 3、断开链内二硫键 4、分析每一多肽链氨基酸组成 5、鉴定多肽链N-末端和C-末端 6、多种方法的部分水解，分离水解后得到的小片段多肽 7、测定上述小片段多肽的序列 8、利用交叉重叠法拼出一条完整多肽链 9、确定二硫键位置,测定步骤,1、测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,2、多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体。 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,3、二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,4、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比； 进行完全水解后用氨基酸自动分析仪测定,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,5、分析多肽链的N-末端和C-末端。 多肽链末端氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,蛋白质一级结构的测定,N末端和C末端残基鉴定,N末端： 1、DNFB（Sanger）法 2、丹磺酰氯（DNS）法 3、PITC（Edman）法 4、酶法 C末端： 1、肼解法 2、酶降解法,末端测序法（1）,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸，其余为游离氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法（层析法）进行鉴定。,N-末端基氨基酸测定,（1）二硝基氟苯（DNFB）法,Sanger试剂(FDNB)标记N末端,Sanger试剂标记反应,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,N-末端基氨基酸测定,（2）丹磺酰氯法,（3）苯异硫氰酸酯法（PITC法）,DABITC ：有色Edman试剂 在Edman试剂上加发色基团,2019/8/26,35,可编辑,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,N-末端基氨基酸测定,（4）氨肽酶法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,C-末端基氨基酸测定,（1） 肼解法,蛋白质与无水肼加热 -NH-CH-CONH-CH-COOH | | Rx Ry - - NH-CH-CONH-NH2 + NH2-CH-COOH | | Rx Ry,C末端的肼(hydrazine)法测定,NH2NH2，100，510h,溶于有机溶剂而被除去,多种方法确定,肼法C端测定,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,C-末端基氨基酸测定,（2）羧肽酶法,测定步骤,6、多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,蛋白质一级结构的测定, 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,重要的具有典型特征的有： 胰蛋白酶：R1=Lys, Arg 糜蛋白酶: R1 =Phe, Tyr, Trp,肽键的专一性水解(酶法),酶法专一性水解, 化学法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,了解,肽键的专一性水解(化学法),化学法: BrCN, H+, NH2OH, etc,化学法专一性水解,测定步骤,7、测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,（1）Edman （苯异硫氰酸酯）法氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,Edman氨基酸顺序分析法,Edman 测序法,Edman降解与DNS-Cl法的结合,DNSEdman法,用DNS法鉴定N-末端氨基酸， 用Edman法降解提供依次减 少一个氨基酸残基的多肽。,（2）其他序列测定法（了解）,酶降解 法 序列 ABCDEFGHIJK- 酶解 AB，CD，EF，GH，IJ， K Edman循环后再酶解 BC，DE，FG，HI，JK，- 质谱法,其它测定方法,利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从N端(aminopeptidase)或C端(carboxypeptidase)一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。,酶解法肽小片段测序,酶解法末端测序,质谱法 Edman循环后看分子量的变化,质谱法,一般测定步骤,8、确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。P179,蛋白质一级结构的测定,一般测定步骤,9、二硫键位置的确定。（了解）,蛋白质一级结构的测定,1、为防止Cys跟Cys-Cys发生交换反应，先 将自由SH基封闭。 2、进行专一性部分水解 3、纸层析分离水解产物 4、气相过甲酸法切断S-S键，作第二相纸层 析 5、将迁移率发生变化的多肽进行测序,经典的二硫键位置的确定法,二硫键位置确定,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链， 再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析， 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,二硫键位置的确定,蛋白质测序举例,1953年，英国Sanger等，牛胰岛素 （1）5.7Kd （2）两条链：A（21AA），B（30AA） （3）A，B间有两个二硫键，A链上有一链内二硫键,The relationship between the amino acid sequences of protein and its function 蛋白质一级结构与功能关系的特点是: A 相同氨基酸组成的蛋白质功能一定相同 B 一级结构相近的蛋白质其功能类似性越大 C 一级结构中任何氨基酸的改变,其生物活性就丧失 D 不同生物来源的同种蛋白质.其一级结构完全相同 E 一级结构中氨基酸残基任何改变,都不会影响其功能 *镰刀状红细胞贫血症,四、蛋白质的序列与生物学功能 （自学）,1.The function of a protein depends on its amino acid sequence,Each separate type of protein has a unique amino acid sequence. Each of the 3000 different proteins in an E.coli cell, the 100,000 ones in a human being has a different amino acid sequence. Proteins of different functions always have different amino acid sequences. Genomic annotation is assigning functions to genes based on sequence information.,Many human genetic diseases have been traced to the deficiency of a single enzyme or protein. The deficiency of many such enzymes are found to be caused by a single change of amino acid residue, indicating protein functions are determined by their amino acid sequences. Proteins that have similar functions but from different species are found to be very similar in amino acid sequences. (cytochrome c, myoglobin, etc.) sequence homology as a basis for phylogenetic trees.,2.Many proteins have variations in their amino acid sequences in the same population (individual polymorphism) or in different species. Many such variations in amino acid sequences, especially in the same population, mostly do not affect protein functions. This phenomenon of amino acid variation in the same population is called polymorphism and widely used in places where identification of individuals are needed (in the court, by examining DNA molecules). Proteins of the same (or similar) functions vary in their amino acid sequences, in proportion to their evolutionary distance or relationship (more different, less similar, farther in relationship).,27 invariant residues (yellow), conservative substitutions (blue) nonconservative or variable residues (unshaded),3.Conservation and variation of cytochrome c sequences,4.The amino acid sequences of proteins provide important biochemical information (application of bioinformatic tools).,A newly revealed amino acid sequence (of well studied or unknown proteins) is usually compared with a large bank of stored sequences. Thousands of sequences have been revealed and stored in computerized databases (e.g., Swiss-Prot, PIR, TreEMBL). Sequence similarity usually reveals functional relatedness.,5.Homologous proteins share a common ancestor during evolution, hence are of the same function. Homology describes the percentage of similarity (or identity) between two proteins (or DNA molecules), usually referring to sequence rather than structure. Amino acid residues between two proteins at certain positions (counting from the N-terminal as 1) can be identical, conservative (similar), or variable. The amino acid sequences of two or more homologous proteins can be compared by sequence alignment.,6.Evolution can be studied quantitatively at the molecular level: phylogenetic trees are made by using the number of residues that differ. Highly conserved residues usually play important roles in protein structure and/or function. (need to be further exploited, e.g. How does it determine the three dimension structure?). Homologous proteins share the same three-dimensional structure. (sequence-structure-function paradigm, unless the structure is flexible and non-unique).,习题,简单蛋白与结合蛋白 多肽链 桑格（Sanger）反应 氨基酸残基 酰胺平面中具有部分双键性质的单键是： A C-C B C-N C N-H D N-C *可用来鉴定蛋白质肽链N-末端氨基酸的试剂是： A 茚三酮 B 亚硝酸 C 甲醛 D 2，4二硝基氟苯 E 异硫氰酸苯酯 *可用来判断蛋白质水解程度的反应是： A 茚三酮反应 B 亚硝酸反应 C 甲醛反应 D 2，4-二硝基氟苯反应 E 异硫氰酸苯酯反应 胰岛素A链与B链的交联靠： A 氢键 B 盐键 C 二硫键 D 酯键 E 范德华力 蛋白质一级结构与功能关系的特点是: A 相同氨基酸组成的蛋白质功能一定相同 B 一级结构相近的蛋白质其功能类似性越大 C 一级结构中任何氨基酸的改变,其生物活性就丧失 D 不同生物来源的同种蛋白质.其一级结构完全相同 E 一级结构中氨基酸残基任何改变,都不会影响其功能,习题,一个蛋白质样品经酸水解后，能用氨基酸自动分析仪准确测定它的所有氨基酸 。 可用8M尿素拆开蛋白质分子中的二硫键。 蛋白质在pI（等电点）时，其溶解度最小 。 有一个七肽, 经分析它的氨基酸组成是: Lys, Gly, Arg, Phe, Ala, Tyr, 和Ser. 此肽未经糜蛋白酶处理时, 与FDNB反应不产生-DNP-氨基酸. 经糜蛋白酶作用后, 此肽断裂成两个肽段, 其氨基酸组成分别为Ala, Tyr, Ser, 和Gly, Phe, Lys, Arg. 这两个肽段分别与FDNB反应, 可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys. 此肽与胰蛋白酶反应, 同样能生成两个肽段, 它们的氨基酸组成分别是Arg, Gly, 和Phe, Tyr, Lys, Ser, Ala. 试问此七肽的一级结构是怎样的? 一个A肽：经酸解分析得知由Lys, His, Asp, Glu2, Ala, 以及Val, Tyr和两个NH3分子组成。当A肽与FDNB试剂反应后,得DNP-Asp; 当用羧肽酶处理后得游离缬氨酸。如果我们在试验中将A肽用胰蛋白酶降解时, 得到二肽, 其中一种( Lys, Asp, Glu, Ala, Tyr)在pH6.4时, 净电荷为零, 另一种(His,Glu,以及Val)可给出DNP-His, 在pH6.4时,带正电荷. 此外, A肽用糜蛋白酶降解时,也得到二种肽, 其中一种(Asp, Ala, Tyr)在pH6.4时呈中性, 另一种(Lys, His, Glu2,以及Val)在pH6.4时,带正电荷，问A肽的氨基酸顺序如何?,有一个七肽, 经分析它的氨基酸组成是: Lys, Gly, Arg, Phe, Ala, Tyr, 和Ser.