课件：二节蛋白质的共价结构.ppt

第二节 蛋白质的共价结构,一、蛋白质通论 二、肽 三、蛋白质一级结构的测定 四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 五、肽和蛋白质的人工合成,(Covalent structure of protein),Protein 来自希腊字母，意思是“头等重要的，原始的” 蛋白质 来源于对蛋清（清蛋白）的研究,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,一、蛋白质通论,1833年 Payen和Persoz分离出淀粉酶。 1864年 Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。 19世纪末 Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽 。 1938年 德国化学家Gerardus J. Mulder引用“Protein” 一词来描述蛋白质。,大事记：,1951年 Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构-螺旋(-helix)。 1953年 Frederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。 1962年 John Kendrew 和 Max Perutz确定了血红蛋 白的四级结构。 20世纪90年代以后 后基因组计划。,（一）什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,有些蛋白质还含有少量的P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se、I等。,C 50 55 % H 6 7 % O 19 24 % N 13 19 % S 0 4 %,主要元素组成,（二）蛋白质的化学组成和分类,1、化学组成：,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%, 蛋白质元素组成的特点,凯氏定氮法：,2、蛋白质的分类,* 根据蛋白质组成成分,* 根据蛋白质形状,纤维状蛋白质：多为结构蛋白，难溶于水， 如丝心蛋白等,球状蛋白质：多数具有生理活性，多数可溶 如血红蛋白、免疫球蛋白等,膜蛋白,简 单 蛋 白,清蛋白和球蛋白 albumin and globulin 广泛存在于动物组织 谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelin and prolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱 精蛋白和组蛋白 碱性蛋白存在于细胞核 硬蛋白,结 合 蛋 白,色蛋白：简单蛋白+色素物质 糖蛋白：简单蛋白+糖类物质 脂蛋白：简单蛋白+脂类结合 核蛋白：简单蛋白+核酸,3、蛋白质的形状,纤维状蛋白质 球状蛋白质 膜结合蛋白质,Collagen Myoglobin Bacteriorhodopsin,4、蛋白质的大小,蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。,1）酶的生物催化作用,（二） 蛋白质具有重要的生物学功能,2）调控作用,参与基因调控：组蛋白、非组蛋白等 参与代谢调控：如激素或生长因子等,3）运动与支持,机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等,4）参与运输贮存的作用,血红蛋白 运输氧 铜蓝蛋白 运输铜 铁蛋白 贮存铁,5）免疫保护作用,抗原抗体反应 凝血机制,6）参与细胞间信息传递,信号传导中的受体、信息分子等,7） 氧化供能,(三)蛋白质的构象与蛋白质的结构组织层次,每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，蛋白质特有的这种天然空间结构，称为构象。 一级结构： 氨基酸顺序 二级结构 ：螺旋、折叠、转角, 无规卷曲 三级结构： 螺旋、折叠、转角 松散肽段借次级键形成球状 四级结构 ：多亚基聚集,二、肽,（一）肽(peptide)的定义,肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,肽键(peptide bond)：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键，本质为酰胺键。 氨基酸残基(residue) :肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。,（二）肽键的结构,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,蛋白质氨基酸残基数的估计,组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为128， 每个氨基酸残基的平均分子量为110； 对于简单蛋白质，用110除它的相对分子量即可约略估计出其氨基酸残基数目。,计算题：,一种蛋白质按其重量含有1.65%亮氨酸和2.48%异亮氨酸，计算该蛋白质最低分子量。（注：两种氨基酸的分子量都是131Da）。,肽 键,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面酰胺平面。 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。,根据形成肽的氨基酸数目，一般氨基酸数目在12个以内时，称为二肽、三肽、四肽等；13个至20个时称为寡肽（oligopeptide）；20个以上称为多肽（polypeptide）。当分子量大到一定程度时，就称为蛋白质。寡肽和多肽的区分完全是人为规定的，其间的界限并不严格。,（三）肽的命名,一条肽链是有方向性的，肽链的一端具有游离的氨基，称其为N端；另一端具有游离的羧基，称其为C端。有少数小分子量的肽，其首尾也缩合成肽键，成为环肽。 对于生物体内的具有特定结构和功能的小分子量肽，还有特别名称，如脑啡肽、内啡肽、催产素、加压素等。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有方向性：,N端,C端,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（四）.肽的理化性质： 1.旋光性 一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的 旋光度的总和。 2.酸碱性质 偶极离子形式存在。 pH014范围内，肽键中的亚氨基不解离 酸碱性质主要取决于： ： ：COOH 侧链上可解离的基团。 肽末端-羧基pKa值比游离AA中的大。 肽末端-氨基pKa值比游离AA中的小。,3.肽的化学反应 肽的羧基，氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。 肽的化学反应和氨基酸的一致，N端的氨基酸残基可以与茚三酮反应。 双缩脲反应是肽和蛋白质特有的，氨基酸没有此反应。,（五） 几种生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),活性肽(active peptide)： 生物体内存在大量的多肽和寡肽有很强的生物活性，称活性肽。,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH有抗氧化剂的作用，可还原细胞内产生的过氧化氢。,谷胱甘肽的生理功用： 解毒作用； 参与氧化还原反应； 保护巯基酶的活性； 抗氧化剂作用，维持红细胞膜的稳定。,体内许多激素属寡肽或多肽,2. 多肽类激素及神经肽,主要存在于指数神经系统，包括脑啡肽、内啡肽、强啡肽等和P-物质。具有吗啡样的镇痛作用。,神经肽(neuropeptide),3、抗菌肽细菌的防御武器,抑制细菌或其他微生物生长或繁殖的物质；由特定微生物产生，最常见的是青霉素，它是由半胱氨酸和缬氨酸结合成的二肽衍生物。主要破坏细菌细胞壁糖肽的合成，引起溶菌。,三、蛋白质一级结构的测定,Protein的一级结构（primary structure) 定义： 是指构成蛋白质的各种氨基酸的种类、数量、连接方式和排列顺序，由遗传信息（遗传密码）所决定。涉及的化学键是肽键和少量的二硫键。 研究意义： 1、从分子水平上研究蛋白质的结构和功能，为蛋白质的人工合成奠定了物质基础。 2、诊断遗传病、合成基因探针等高新技术的研究具有重要意义。,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,（一）蛋白质测序的要求,1，样品必需纯（97%以上）； 2，知道蛋白质的分子量； 3，知道蛋白质由几个亚基组成； 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,2019/8/26,41,可编辑,（二）测定步骤,1、多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,1、多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定,2、测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,3、二硫键的断裂,4、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；,蛋白质一级结构的测定,氨基酸自动分析仪和肽链氨基酸顺序自动测定仪，对蛋白质多肽氨基酸排列顺序的测定提供了极大的方便。,1、N末端分析,二硝基氟苯法（DNFB法）：用DNFB（Sanger试剂）与肽链N末端的氨基反应，生成DNP多肽或DNP蛋白质。然后水解肽链，分离得到DNP氨基酸，纸层析、薄层层析或HPLC分离鉴定。 丹磺酰氯法（DNS法）：与DNFB法类似，由于丹磺酰氯有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍。,（三）N-末端和C-末端氨基酸残基的测定,苯异硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽链与PITC（Edman试剂）反应生成PTC多肽或PTC蛋白质，在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物（PTH氨基酸）并从肽链上脱落下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。分离PTH氨基酸并鉴定。 氨肽酶法：根据游离氨基酸出现的时间顺序分析N末端氨基酸。值得注意是不同的N末端氨基酸水解的速度不同，有时难以分析。,2、C末端分析,（1）肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解。反应中除C末端氨基酸以游离形式存在外，其它氨基酸都转变成相应的氨基酸酰肼。反应中生成的氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中游离的C末端氨基酸借助DNFB法或DNS法鉴定。,肼解法反应式,（2）还原法：肽链C末端的氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的氨基醇，肽链水解后层析鉴定。,（3）羧肽酶法：目前常用的有4种羧肽酶：A、B、C和Y。羧肽酶A能释放除Pro、Arg和Lys之外的任何一种C末端氨基酸；羧肽酶B只能水解以碱性氨基酸Arg和Lys为C末端的氨基酸；羧肽酶C和Y可以释放任何一种C末端氨基酸。,-Val-Ser-Gly,还原法断裂二硫桥,巯基保护反应,（四）二硫桥的断裂,氧化法断裂二硫桥,过甲酸,（五）氨基酸组成的分析,酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸，碱水解分析色氨酸。 氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚三酮染色，比色定量。,氨基酸分析仪示意图,长柱用于分离酸性和中性氨基酸,短柱用于分离碱性氨基酸和氨,柱中填料为细粒聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂,氨基酸的离子交换柱层析图谱,洗脱曲线,（六）多肽链的部分裂解,酶裂解法：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等，它们各自有自己的水解专一性。蛋白酶分为内肽酶和外肽酶（羧肽酶、氨肽酶）。 化学裂解法：溴化氰（只裂解由Met的羧基形成的肽键，选择性）、羟胺（裂解Asn-Gly之间的肽键，也能部分裂解Asn-Leu及Asn-Ala之间的肽键，专一性）。,蛋白酶的专一性,溴化氰裂解法,溴化氰只裂解由Met的羧基形成的肽键,肽段的分离纯化 A.电泳法 : 根据分子量大小分离 B.离子交换层析法:根据肽段的电 荷特性分离。 C.液相HPLC法:根据肽段的极性 分离。 D.凝胶过滤：分子筛。,（七）氨基酸序列测定,1、质谱法：两台质谱仪联用，第一台质谱仪通过电喷射电离使肽段带上电荷，将不同大小的肽段分离。第二台质谱仪分析肽段的序列。在第二台质谱仪上，小肽段在碰撞池中与氮气分子或氩气分子碰撞，碎裂成依次少一个氨基酸残基的碎片，分析这些碎片的质量差，可得出序列。 特点：灵敏度高、所需样品少、测定速度快。,串联质谱仪,串联质谱测序工作原理,分离肽段,测序,2、Edman降解法：由N端向C端逐步降解。先将被测肽段的羧基端固定到不溶性的树脂上，便于分离切下的氨基酸和剩余的肽段。 3、酶降解法：用外肽酶逐个切下氨基酸分析。只能分析很少的几个氨基酸。 4、根据核苷酸序列的推定法：找到该蛋白质的基因，从基因的编码序列按三联密码推出氨基酸序列。,同源蛋白质：来自不同生物体、 执行同一 /相似功能的蛋白质 同种蛋白质：来自相同生物体、 执行同一功能的蛋白质,1、同源蛋白质,三、蛋白质的AA序列与生物功能,（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化,一百多个AA残基 MW约12.5103 2 8个不变残基,2、细胞色素C与系统树,invariant residues (yellow) conservative substitutions (blue) nonconservative or variable residues (unshaded),Conservation and variation of cytochrome c sequences,对不同种属的细胞色素c的研究同样指出具有同种功能的蛋白质在结构上的相似性。 对100个种属的细胞色素c的一级结构进行了分析，发现亲缘关系越近，其结构越相似。 细胞色素c的氨基酸顺序分析资料已经用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树。 根据进化树不仅可以研究从单细胞到多细胞的生物进化过程，还可以粗略估计各种生物的分化时间。,1、氧合血红蛋白,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源,该酶类活性中心的Ser残基起关键作用 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、 凝血酶和纤溶酶 有序列同源性 对底物偏爱不同,2、丝氨酸蛋白酶类,（三）血液凝固与AA序列的局部断裂,凝血酶原,血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。,可溶性的 血纤蛋白原,酶,有活性的凝血酶,不溶性的 血纤蛋白网,（一）肽的人工合成 保护