课件：二蛋白质化学.pptx

第二章 蛋白质化学,Chemistry of Protein,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,氨基酸是什么？,二、蛋白质的生物学重要性,1、蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,（1）作为生物催化剂（酶） （2）代谢调节作用 （3）免疫保护作用 （4）物质的转运和存储 （5）运动与支持作用 （6）参与细胞间信息传递,2、蛋白质具有重要的生物学功能,3、氧化供能,本章主要内容：,第一节、蛋白质的分子组成 第二节、蛋白质的分子结构 第三节、蛋白质结构与功能的关系 第四节、蛋白质的理化性质 第五节、蛋白质的分离纯化,The Molecular Component of Protein,第一节、蛋白质的分子组成, 组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,（1）各种蛋白质的含氮（N）量很接近，平均为16%。,（2）通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：, 蛋白质元素组成的特点：,（3）测氮的方法：凯氏定氮法,蛋白质含量 ( g % ) = 含氮量( g % ) 6.25,计算题：？,测得1g玉米样品的含氮量为10mg，则样品中蛋白质的含量有 mg，蛋白质的含量占样品的百分含量为 %。,答案：,测得1g玉米样品的含氮量为10mg，则样品中蛋白质的含量有 62.5 mg，蛋白质的含量占样品的百分含量为 6.25 %。,一、氨基酸(amino acids) 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,氨基酸的结构通式：,1、非极性疏水性氨基酸（8种） 2、极性不带电荷氨基酸（7种） 3、碱性氨基酸（3种） 4、酸性氨基酸（2种）,（一）氨基酸的分类,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,1、非极性疏水性氨基酸（8种）,丙氨酸（Ala）,缬氨酸（Val）, 亮氨酸（Leu）,异亮氨酸（Ile）, 甲硫氨酸（Met）,脯氨酸（Pro）, 苯丙氨酸（Phe）,色氨酸（Trp）,2、极性不带电荷氨基酸（7种）,甘氨酸（Gly）,丝氨酸（Ser）, 苏氨酸（Thr）,半胱氨酸（Cys）, 酪氨酸（Tyr）,天冬酰胺（Asn）, 谷氨酰胺（Gln）,3、碱性氨基酸（3种）,4、酸性氨基酸（2种）,习惯分类方法 1、芳香族氨基酸：Trp、Tyr、Phe 2、含羟基氨基酸：Ser、Thr、Tyr 3、含硫氨基酸：Cys、Met 4、杂环族氨基酸：His 5、杂环族亚氨基酸：Pro 6、支链氨基酸：Val、Leu、Ile,几种特殊氨基酸, 脯氨酸（Pro） （亚氨基酸）, 半胱氨酸（Cys）：可形成二硫键。,小结：,据R基团极性分类,极性R基团AA,非极性R基团AA（8种）,不带电荷（7种）,据氨基、羧基数分类,一氨基一羧基,一氨基二羧基(Glu、Asp),二氨基一羧基(Lys、His、Arg),人的必需氨基酸 Lys Trp Phe Val Met Leu Ile Thr Arg、His,带电荷：正电荷（种）负电荷（种）,（二）氨基酸的理化性质,1、两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,H2O,H2O,甘 氨 酸 滴 定 曲 线,甘氨酸盐酸盐（A+）,等电点甘氨酸（A）,甘氨酸钠（A-）,等电点(isoelectric point, pI) ： 氨基酸酸性解离和碱性解离的程度相等，分子所带的净电荷为零，此时溶液的pH值就称为该氨基酸等电点。,pI=1/2（pK1+pK2）,2、紫外吸收特性,在 280 nm 附近 苯丙氨酸（Phe） 色氨酸(Trp) 酪氨酸(Tyr),芳香族氨基酸的紫外吸收,3、氨基酸的化学反应, 与茚三酮反应 2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应 苯异硫氰酯（PITC）的反应,（1） 茚三酮反应,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，但是脯氨酸例外，脯氨酸与茚三酮反应，生成黄色的产物。,DNFB（dinitrofiuorobenzene）,DNP-AA(黄色),+,+ HF,氨基酸,（2）2,4一二硝基氟苯的反应（sanger反应）,（3）苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）,PITC（phenylisothiocyanate）,+,苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）,重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序,多肽顺序自动分析仪：,二、肽(peptide), 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一） 肽键,蛋白质中氨基酸的连接方式,肽键,多肽链结构示意图,肽单位,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,肽平面,C N,O,H,C,C,-,0.133nm,1180,1210,1160,1230,1200,1220,C-N：单键 0.145nm C=N：双键 0.125nm,肽单位,肽单元,肽键(-CONH- ) 中的个原子和个碳原子( C)被约束在一个刚性平面（即肽键平面）上，构成一个肽单元(peptide unit)。,肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二） 几种生物活性肽,1、谷胱甘肽(glutathione, GSH):广泛存在于动、植物和微生物细胞中，在酵母、小麦胚芽、动物肝脏中含量比较高。,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，防止过氧化物积累。,人体血液：26-34mg/100g，动物肝脏：100-1000mg/100g。,2、多肽类激素及神经肽,由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促甲状腺素(调节糖代谢)。,The Molecular Structure of Protein,第二节、蛋白质的分子结构, 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),蛋白质的分子结构包括：,蛋白质结构的主要层次,一级结构,四级结构,二级结构,三级结构,primary structure,secondary structure,tertiary structure,quariernary structure, 定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,一、蛋白质的一级结构, 主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,胰岛素的一级结构,30,21,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。, 主要的化学键：氢键,二、蛋白质的二级结构,蛋白质二级结构的主要形式：,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),（一）、 -螺旋 ( -helix ),特征： （1）多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧； （2）每隔3.6个AA残基螺旋上升一圈，螺距0.54nm； （3）每个氨基酸残基的N-H与前面第四个氨基酸残基的C=0形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。,类别： 平行 反平行,（二）、 -折叠 ( -pleated sheet ),特征：多肽链中氨基酸残基n的羰基上的氧与残基（n+3）的氮原上的氢之间形成氢键，肽键回折1800 。,（三）、 -转角 ( -turn ),无规则卷曲示意图,无规则卷曲,细胞色素C的三级结构,（四）、无规卷曲 ( random coil ),超二级结构(super-secondary structure),类型：单元； X单元； -迂回；回形拓扑结构 一些已知功能的超二级结构，也称为模体(motif) : 螺旋-回折-螺旋（helix-turn-helix，HTH） 锌指（zine Finger,ZF） 亮氨酸拉链（leucine zipper,LZ） 螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix,HLH） EF手（EF-hand）,1 2 3 4 5,5 2 3 4 1,-链, -迂回,回形拓扑结构,回形拓扑结构, -迂回,螺旋区-回折-螺旋识别特定的DNA碱基序列,COOH,NH2,识别螺旋,亮氨酸拉链蛋白结合在一个回文的靶DNA序列上,回文的靶DNA序列,亮氨酸拉链蛋白,EF手图象(钙调蛋白的钙结合位点),Ca2+,E helix,F helix,E,F,结构域 (structure domain),具有独立的结构单位、独立的功能单位和独立的折叠单位。,丙糖磷酸异构酶, 主要的化学键：,三、蛋白质的三级结构,疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。,肌红蛋白（Myoglobin）的三级结构,2019/8/28,69,可编辑,卵溶菌酶（egg lysozyme）的三级结构,含有螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲四种二级结构, 蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。 大多数非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核；而极性侧链在分子表面，形成亲水面。 分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋白质的活性中心。,球状蛋白的三级的结构特怔：,四、蛋白质的四级结构, 亚基（subunit） 本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。对称性是四级结构蛋白质最重要的性质之一。,免疫球蛋白IgG的一级结构,IgG的空间结构,血红蛋白（Hb）的四级结构,血红蛋白的一、二、三、四级结构,小结：蛋白质的分子结构层次,五、蛋白质一级结构的测定,胰岛素的一级结构,蛋白质一级结构的测定思路,二 硫 键 的 断 裂,第一步,第二步 测定肽链的氨基末端和羧基末端,丹磺酰氯是一种强荧光剂，可鉴定出N-端氨基酸。,1、N末端的测定-丹磺酰氯法 2、C末端的测定-羧基肽酶法,多肽,（Phe.Tyr.Trp）,（Arg.Lys）,（脂肪族）,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,弹性蛋白酶,羧肽酶,胰蛋白酶,氨肽酶,羧肽酶,（Phe. Trp）,1、 酶解法,第三步 肽链的局部水解,CNBr与Met反应测定蛋白质的一级结构,2、化学法,例：有一条由8个氨基酸组成的多肽链；Ala,Lys,Met,Ser,Thr,Tyr,(Gly)2; (1)用溴化氰裂解，得到两条肽链： A: Ala, Gly, Lys, Thr； B: Gly, Met, Ser, Tyr (2)用胰蛋白酶水解，得到两条肽链： A：Ala，Gly； B：Gly，Lys, Met, Ser, Thr, Tyr (3)用胰凝乳蛋白酶水解，得到两条肽链： A：Gly, Tyr； B: Ala, Gly, Lys，Met, Ser, Thr 已知Gly位于肽链的两端，试推测该肽链的氨基酸排列顺序。,Gly-Tyr-Ser-Met-Thr-Lys-Ala-Gly,答案：,根据如下结果推断多肽链的氨基酸排列顺序： (1)氨基酸的组成： Met, Tyr, Ser, Phe, Gly, Lys, Ala； (2)用Sanger试剂得到唯一的DNPLys； (3)用溴化氰裂解，得到两条肽链： A:Lys, Met；B: Tyr, Ser, Phe, Gly, Ala； (4)用羧肽酶处理，Gly迅速释放； (5)用胰凝乳蛋白酶处理，含3条肽链： A: Tyr, Lys, Met；B: Ala, Gly； C: Ser, Phe 试推测该肽链的氨基酸排列顺序。,Lys-Met-Tyr-Ser-Phe-Ala-Gly,答案：,The Relation of Structure and Function of Protein,第三节、蛋白质结构与功能的关系,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,20世纪50年代末，美国学者Stanford Moore等完成该酶的全序列分析。它是第一个被测出一级结构的酶分子，含124个氨基酸，4对二硫键，分子量为12600。,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）一级结构与功能的关系,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,正常红细胞 镰刀形红细胞,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,正常：Glu DNA模板链： 3-C T T-5 5-3 Glu遗传密码mRNA： 5-GAA-3,非正常：Val DNA模板链： 3-C A T-5 5-3 Val遗传密码mRNA： 5-GUA-3,转录,转录,因为突变发生在碱基（分子水平）上，所以称为“分子病”。,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构,二、蛋白质空间结构与功能的关系,肌红蛋白 血红蛋白,肌红蛋白（Mb）:具有简单的三级结构，是脊椎动物肌肉中的一个小的胞内蛋白，在潜水哺乳类（鲸、海豹、海豚）肌肉细胞中含量丰富，以致使他们的肌肉呈棕红色。肌红蛋白的主要作用是贮存氧，使这些动物能长期潜在水下。 血红蛋白（Hb）：具有四级结构，存在于血液的红细胞中，主要作用是结合和转运氧。,肌红蛋白（Mb）:153个AA+1个血红素辅基（heme） 血红蛋白（Hb）：2个亚基，2个亚基： 亚基：141个AA+1个血红素辅基（heme）； 亚基：146个AA+1个血红素辅基（heme）,肌红蛋白 血红蛋白,血液循环： 在肺部经气体交换，富含O2的动脉血经心脏流向各组织器官， O2被消耗，缺O2的静脉血回流至心脏，再到肺部进行气体交换。,红细胞： 在成熟期间产生大量的血红蛋白（每个红细胞约含3亿个血红蛋白Hb分子）。并失去胞内的细胞器-核、线粒体和内质网，所以红细胞是一种高度分化的细胞。,血红素（heme）与氧结合后： Fe2+ Fe3+,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,当氧饱和度YO2为50%时， 肌红蛋白（Mb）： PO2= 2.8torr； 血红蛋白（Hb） ：PO2 =26torr。 说明：肌红蛋白与氧的亲和力更高。肌红蛋白（Mb）：双曲线； 血红蛋白（Hb）：S形曲线,* 协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 促进作用称为正协同效应 (positive cooperativity) 抑制作用称为负协同效应 (negative cooperativity),肌红蛋白（Mb）,在肺部：血液循环中的红细胞富含O2 。 在肌肉组织中：肌红蛋白（Mb）迅速接纳来自血红蛋白（Hb）的O2。,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,对于肌红蛋白(Mb)： 在动脉血PO2：100torr， YO2=0.97； 在静脉血PO2：20torr，YO2=0.91。 相差：0.06 说明：肌红蛋白能有效地将从肺部经血液循环转运至肌肉细胞的氧储存起来。,血红蛋白（Hb）,在肺部：血液循环中的红细胞富含O2 。 在肌肉毛细血管中：富含O2血红蛋白（Mb）缓慢地释放O2 ，以供给肌肉细胞生命活动的需要。,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,对于血红蛋白(Hb)： 在动脉血PO2：100torr， YO2=0.97； 在静脉血PO2：20torr ，YO2=0.25。 相差：0.72 说明：血红蛋白能有效地将氧气从肺部经血液循环运送至肌肉细胞中利用。,小结： 在经过肌肉组织时，富含O2的血红蛋白将O2释放出来，由肌红蛋白接纳。肌红蛋白将O2储存在肌肉细胞中。缺O2的血红蛋白回流至心脏，再到肺部进行气体交换。,20torr,100torr,1、血红蛋白（Hb）的亚基、亚基和肌红蛋白（Mb）在三级结构上很相似，这反映在它们的功能相似性，即都能与氧结合。,小结：蛋白质结构与功能的关系,myoglobin chain hemoglobin,小结：,2、由于肌红蛋白（Mb）具有简单三级结构，所以很容易与氧结合和解离，其主要功能：是储存O2 。在肌肉收缩线粒体中氧含量下降时，可立即供应氧； 3、血红蛋白（Hb）由于具有复杂的四级结构，与氧的结合具有协同效应，所以其主要功能：是运输O2 （从肺部转运至肌肉细胞中利用），而且还能运输H+，CO2 。,这也进一步说明了：蛋白质的空间结构决定了蛋白质的生物学功能。,（二）蛋白质构象改变与疾病, 蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。, 这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。,PrPc -螺旋,PrPsc -折叠,正常,疯牛病,阮病毒病.swf 2min,第四节、蛋白质的理化性质 The Physical and Chemical Characters of Protein,一、蛋白质的两性电离,H+,H+,二、蛋白质的胶体性质,由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。,水化膜,蛋白质的沉淀,沉淀方法类别: 1、高浓度中性盐（盐析、盐溶） 2、酸碱（等电点沉淀） 3、有机溶剂沉淀 4、重金属盐类沉淀 5、生物碱试剂和某些酸类沉淀 6、加热变性沉淀,三、蛋白质的变性(denaturation),变性！,沉淀！,？,四、蛋白质的紫外吸收光谱,蛋白质在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。,五、蛋白质的呈色反应,