课件：第二章-蛋白质.ppt

,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。 蛋白质是遗传信息的执行者!具有生物种,甚至个体特异性!,第二章 蛋白质(Protein)化学,蛋白质在生命中的重要性 早在1878年，思格斯就在反杜林论中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。” 可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的研究结果表明蛋白体实际上是核酸与蛋白质的复合体。说明蛋白质的重要性。,蛋白质是生物体内必不可少的重要成分,蛋白质占干重 人体中（中年人） 人体 45% 水55% 细菌 50%80% 蛋白质19% 真菌 14%52% 脂肪19% 酵母菌 14%50% 糖类1% 白地菌50% 无机盐7%,蛋白质是遗传信息的执行者或生物功能的主要体现者,（1）酶的催化作用 （2）调节作用(多肽类激素) （3）运输功能 （4）运动功能 （5）免疫保护作用(抗体、干扰素) （6）接受、传递信息的受体 ,蛋白质的元素组成,碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其它 微量,1mg氮6.25mg蛋白质,第一节 氨基酸,一、氨基酸的结构与分类,(2) 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,1.氨基酸的结构 氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,(1) 与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸,COOH H2N CH -碳原子基团 R R基团,-氨基酸基本结构通式,注意：构型与旋光方向二者没有直接对应的关系。各种L氨基酸中有的为左旋，有的为右旋，即使同一种L氨基酸，在不同溶剂中测定时，其比旋光值和旋光方向也会不同。,2.常见氨基酸的分类,极性AA （1）按R基团的极性分 非极性AA,脂肪族AA （2）按R基团的化学结构分 芳香族AA 杂环族AA,3.人体所需的八种必需氨基酸 人体必不可少，而机体内又不能合成的，必须从食物中补充的氨基酸，称必需氨基酸。 赖氨酸(Lys) 缬氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Trp) 亮氨酸(Leu) 异亮氨酸(Ile) 苏氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe),酸性AA 碱性AA 非解离AA,（3）从营养学角度分,非必需AA 必需AA,4.蛋白质代谢中还存在的氨基酸,鸟氨酸（Orn）,瓜氨酸（Cit）,胱氨酸,二.氨基酸的重要理化性质 1.一般物理性质,溶解性：常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 (2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。 (3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。 (5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)由于酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的R基团含有苯环共轭双键系统，有吸收光的能力。,酪氨酸 max275nm，275=1.4x103; 苯丙氨酸 max257nm，257=2.0x102; 色氨酸 max280nm，280=5.6x103;,蛋白质由于含有这些氨基酸，一般最大光吸收在波长280nm处，因此利用紫外分光光度计能很方便地测定蛋白质的含量。,2.氨基酸的离解性质 氨基酸同时含有碱性的氨基和酸性的羧基，是一种两性电解质。在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。 在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子 负离子,3.氨基酸的等电点,当调节氨基酸溶液的pH值，使氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，即净电荷为0，在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时氨基酸所处溶液的pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。 在等电点时，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀，利用这一性质可以分离制备某些氨基酸。 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR )/2,氨基酸的 带电状态和在电场中的状况：,脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮生成黄色化合物。 此反应非常灵敏，根据紫色的深浅，在570nm波长（或根据黄色深浅在440nm波长）下测定光吸收值，就可测定样品中氨基酸含量。 采用纸层析、离子交换层析和电泳等技术分离氨基酸时，常用茚三酮溶液做显色剂，以定性和定量测定氨基酸。,4.氨基酸的化学性质,(1)与茚三酮的反应（颜色反应）,H2O,NH3CO2RCHO,2NH3,3H2O,紫色化合物,(2)与甲醛反应,反应特点 A.为- NH2的反应 B.在常温，中性条件，甲醛与- NH2很快反应，生成羟甲基氨基酸，释放氢离子。 应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定） A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1） D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,反应特点 A.为- NH2的反应 B.氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃) C.DNP-氨基酸为黄色，稳定。 D.多肽或蛋白质N端氨基酸的- NH2也能与DNFB反应，生成DNP多肽或DNP蛋白质。 应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸,(3) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应,首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽 B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸 D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类,(4)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,+,a.肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽（苯胺基硫甲酰肽）。 b.环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸（苯乙内酰硫脲）。 c.分离PTH-氨基酸,用层析法鉴定，确定肽链的N端氨基酸种类。 d.此法也叫“Edman”反应，“多肽顺序自动分析仪”就是根据这个原理。,弱碱,酸,第二节 蛋白质的分子结构,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。,一.基本问题-肽 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。 由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： 丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰胺 Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,1.多肽,2.天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽等。,催产素 加压素,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽,二.蛋白质的一级结构,1. 蛋白质的一级结构(Primary structure) 蛋白质分子中氨基酸残基从N末端到C末端的排列顺序，即氨基酸的序列，是蛋白质最基本的结构。,2.蛋白质的一级结构的测定,测定蛋白质的一级结构的要点 a.测定蛋白质中氨基酸组成。 b.蛋白质的N端和C端的测定。 c.应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂，各自得到一系列大小不同的肽段。 d.分离提纯所产生的肽，并测定它们的序列。 e.从有重叠结构的各个肽的序列中推断出蛋白质中全部的氨基酸排列顺序。,(2)测定步骤 多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数，即可确定多肽链的数目。 二硫键的断裂：肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,巯基的保护,Sanger法 Edman法,分析多肽链的N-末端和C-末端,c.氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,D.肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,E.羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除脯氨酸,精氨酸和赖氨酸以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解精氨酸和赖氨酸为C-末端残基的肽键。,多肽链断裂成多个肽段：可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解的方法有：,a.酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶。 b.化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,测定每个肽段的氨基酸顺序。 确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,三.蛋白质的空间结构 1.蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构(Secondary structure) 主要是指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲。,（1）多肽链折叠的空间限制,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共振相互作用，形成共振杂化体。 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 组成肽键的原子处于同一平面，此平面称为肽平面。其中CO与NH以及两个C均呈反式构型。 R侧链基团处于肽平面的外侧，影响构象的主要是R侧链。,多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，可以是左手螺旋，也可以是右手螺旋。天然蛋白质中的-螺旋一般是右手螺旋。螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm. 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。 由于脯氨酸的亚氨基参与形成肽键后，氮原子上已没有氢原子，无法形成氢键，使螺旋中断，形成“结节”。,左手和右手螺旋,（2）构象单元 -螺旋, -折叠 -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。 -折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。 在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm 。 -折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。,-转角 在-转角部分，由四个氨基酸残基组成.四个形成转角的残基中，第三个一般均为甘氨酸残基弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,无规则卷曲 无规则卷曲也叫自由回转，没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象不同的蛋白质，自由回转的数量和形式各不相同分两类： 紧密环 连接条带,2019/8/30,31,可编辑,超二级结构和结构域 （）超二级结构 在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构： ； 超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域, ,（）结构域 对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的、在空间上能辨认的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体就称结构域。 结构域通常是几个超二级结构的组合，充当三级结构的配件。对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。 结构域一般由100200个氨基酸残基组成，但大小范围可达 40400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上 结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。 在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性,蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构。包括主链和侧链的所有原子的空间排布。一般非极性氨基酸残基埋在分子内部，它们之间的疏水作用维系并稳定已经形成的三级结构，极性氨基酸残基在分子表面，赋予蛋白质亲水的性质。,蛋白质的四级结构 许多蛋白质是由两个或两个以上独立的三级结构通过非共价键结合成的多聚体，称为寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元称为亚基。蛋白质的四级结构是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。如，血红蛋白的四级结构得测定由佩鲁茨1958年完成，其结构要点为： 球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基 两个亚基，两个亚基 亚基：141个残基；亚基：146个残基 分子量65 000 含四个血红素辅基 亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部,一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构,a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键,氢键、范德华力、疏水相互作用力、离子键，均为次级键 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定 配位键：两个原子由单方提供共用电子对形成的共价键，金属离子往往以共价键和蛋白质连接。,四蛋白质分子中的共价键与次级键,第三节 蛋白质分子结构与功能的关系,一.蛋白质一级结构与功能的关系 研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的氨基酸残基与生物功能的关系。 1.一级结构的变异与分子病 镰刀形细胞贫血病 患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S） 它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于链的N-末端第6位残基发生了变化 （Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基 使血红蛋白细胞在氧气缺乏时收缩成镰刀形，易胀破发生溶血，输氧能力下降，引起贫血症状。 这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性,2. 一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子. 例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原 前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽. 信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。 胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽， 只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.,3.一级结构的种属差异与分子进化 同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近. 例：细胞色素C 60 个物种中，有 27 个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基. 可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素 C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.,黄色： 不变残基（invariable residues） 蓝色 ： 保守氨基酸（conservative residues） 未标记：可变残基（variable residues）,二.蛋白质的空间结构与功能的关系 别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象.它是细胞内最简单的调节方式. 例：血红蛋白的别构效应 一个亚基上的血红素与氧结合后，引起该亚基构象改变 进而引起另三个亚基的构象改变 整个分子构象改变 与氧的结合能力增加,第四节 蛋白质的性质,一.蛋白质的相对分子质量 蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于10 000.最高可达40 000 000（烟草花叶病毒） 1.根据化学成分测定最小相对分子质量 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量 然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量： 最小相对分子质量（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量 如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。,2. 超离心法 在60 00080 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子沉降。 当许多蛋白质分子的大小和形状都相同时，下沉速度相同，在离心管中产生明显的界面，用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。 一种蛋白质分子在单位离心力场里的沉降速度为恒定值，称为沉降系数。用11013秒作为沉降系数的一个单位，用S表示。 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，相对分子质量越大，S值越大，蛋白质的沉降系数：1200S,3.凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex 测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线 再测出未知样品洗脱体积Ve 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量,4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状） SDS:十二烷基硫酸钠，去垢剂 用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理，蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物，且均带上负电荷，从而掩盖蛋白质原有电荷和形状的差异，使电泳速度只与蛋白质相对分子质量有关 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图 测出待测样品的迁移率 从标准曲线上查出样品的相对分子质量,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图,二. 蛋白质的两性离解和电泳现象 1.两性解离现象 蛋白质与氨基酸、多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。 当溶液在某一定pH值的环境中，使蛋白质所带的正电荷和负电荷恰好相等，即总净电荷为零，在电场中，蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点(Isoelectric point pI)。 在等电点时，蛋白质的溶解度最小，易沉淀析出，常用于蛋白质的分离、提纯。同时在等电点时蛋白质的粘度、渗透压、膨胀性以及导电能力均为最小。,2.电泳现象 带电的胶体颗粒在电场中可以向电荷相反的电极移动。由于蛋白质在溶液中解离成带电的颗粒，因此在电场中能移动，这种大分子化合物在电场中移动的现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。 蛋白质电泳的方向、速度主要取决于其所带的电荷的正负性，所带电荷的多少以及分子颗粒大小。,三.蛋白质的胶体性质 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动以及不能透过半透膜等。 胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 可溶性蛋白质分子表面分布大量的极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。,四.蛋白质的沉淀作用 在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏蛋白质的水膜或中和蛋白质的电荷，使蛋白质胶体溶液不稳定而出现沉淀现象。 1.加高浓度盐类 硫酸铵、硫酸钠、氯化钠破坏蛋白质的水膜，中和电荷，使蛋白质沉淀。这种加盐使蛋白质析出的现象叫盐析。 分段盐析：调节盐浓度，使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，是可逆沉淀。 2.加有机溶剂 酒精、丙酮等有机溶剂破坏蛋白质的水膜，使其沉淀。 低温时是可逆沉淀。 3.加重金属盐 硝酸银、醋酸铅、氯化高汞等重金属的正离子与在碱性环境中的带负电荷的蛋白质作用生成不易溶解的盐而沉淀。 破坏蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水，是不可逆沉淀。 4.加某些酸类 苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。 不可逆沉淀。,五.蛋白质的变性和复性 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。受某些物理或化学因素的影响，其分子内部原有的高级结构发生变化，引起蛋白质理化性质和生物学性质都有所改变，但并不导致蛋白质一级结构破坏，这种现象称为蛋白质的变性.,变性后的蛋白质失去生物活性，溶解度降低、易沉淀析出，肽链松散、可反应基团增多、易消化等。 引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌、X射线照射以及强酸、强碱、重金属盐、尿素、胍、去污剂等。,变性蛋白质在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原有地构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性。,六.蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 核酸在260nm有最大吸收峰，常对蛋白质含量的测 定造成干扰，用下式校正： 蛋白质含量1.55A2800.76A260,七.蛋白质的颜色反应,1.双缩脲反应： 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应 肽键的反应，肽键越多颜色越深 受蛋白质特异性影响小 蛋白质定量测定,2.米伦氏反应 酪氨酸的显色反应（酚羟基反应） 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色 3.乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成 色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸 4.坂口反应 精氨酸的反应（胍基的反应） 精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物 鉴定蛋白质中是否含有精氨酸 定量测定精氨酸,5.福林试剂反应 酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应） 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸和碱性硫酸铜 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合