课件：止凝血实验诊断学临床本科.ppt

血栓与止血的检验 (Laboratory Diagnosis of Thrombosis and Hemostasis),南方医科大学第一临床医学院 实验诊断学教研室 李强,广东省精品课程: 实验诊断学 ( ),一、基础理论,（1）止血机制（血管壁、血小板） （2）凝血系统和抗凝机制 （3）纤溶系统,止血机制,一、血管的止血功能 (Hemostastic function of blood vessel wall),.神经反射,管腔收缩,血流变慢,出血/停止,.内皮细胞分泌vWF、Fn、PAF,促进plt粘附、聚集,.释放FIII,启动外源性凝血途径,.暴露内皮下胶原,促进血小板粘附 启动内源性凝血途径,二、血小板的止血作用 ( Hemostatic function of platelets) 维持血管壁的完整性，毛细血管的通透性 粘附、聚集在血管破损处，形成白色血栓 释放活性物质，促进血小板聚集，增强血管收缩 促进凝血过程 血块收缩，形成稳固血栓,三、凝血因素(Blood coagulation) 激活内、外源凝血途径， 形成纤维蛋白网 止血血栓（红色血栓）,凝血机制 (Mechanism of coagulation),一、 凝血因子( Coagulation factors)： 目前公认的凝血因子共14个，按罗马字命名的有 12个，尚有高分子量激肽原(HMWK)，激肽释放酶原(PK) 除因子IV（Ca2+）外，其他均为蛋白质；除因子III（组织因子，TF）外，其他均存在血浆中 大多数由肝脏产生，其中II、VII、IX、X合成依赖于Vitk，称Vitk依赖因子 正常情况下，所有因子都处于无活性状态,二、凝血过程(Coagulation pathway)： 第一阶段 凝血酶原酶生成 内源性凝血途径 外源性凝血途径 第二阶段 凝血酶生成 第三阶段 纤维蛋白生成,内源性凝血途径( intrinsic),外源性凝血途径(extrinsic),正常抗凝机制 ( Mechanism of anticoagulation),血液中存在多种抗凝物质及抗凝系统 1抗凝血酶（antithrombin ，AT） 占体内总抗凝功能的50-67% AT 灭活IIa、IXa、Xa、a、 XIIa 、激肽释放酶,肝素,抗凝血酶(AT) 抗凝机制,2. 组织因子途径抑制物 (tissue factor pathway inhibitor TFPI),3. 蛋白C系统,蛋白C（Protein C, PC） 蛋白S（Protein S, PS) 血栓调节素（thrombomodulin, TM） 活化蛋白C抑制物(activated protein C inhibitor, APCI ),蛋白C系统抗凝机制,主要作用：分解纤维蛋白（原），清除血管 内由于纤维蛋白沉积引起的阻塞，保持血流通畅,XIIa PK,纤溶酶原,纤溶酶,u-PA t-PA,-,PAI,-,2- AP,纤溶系统（fibrinolysis）,纤维蛋白生成和降解,非交叉连接纤维蛋白,交叉连接纤维蛋白,纤溶酶,纤溶酶,FPA,FPB,凝血酶,因子XIIIa,纤维蛋白原,纤溶酶,二、检验项目,（1）血管壁的检验 （2）血小板的检验 （3）凝血功能检验 （4）抗凝物质检查 （5）纤溶功能检查,血管壁的检验,一、毛细血管抵抗力试验（capillary resistance test, CRT），毛细血管脆性试验，束臂试验 原理：对毛细血管施加压力，观察血管壁、血管 内皮细胞、 血小板综合止血作用 参考值：5cm直径圆圈内，男性5个出血点， 女性及儿童10个出血点 临床意义：抵抗力减弱：血管病变；血小板减少； 血小板功能异常；血管性血友病,筛检试验,CRT (capillary resistance test),二、出血时间（Bleeding Time，BT）测定 原理：皮肤毛细血管刺破，出血自然停止所需的时间。 主要受血小板数量和功能影响， 其次受血管壁完整性和收缩功能影响， 凝血因子影响较小 参考值：标准化出血时间测定器法（template bleeding time,TBT) 6.92.1min, 超过9min为异常,标准化出血时间测定器法测定BT,临床意义： 延长见于： 1 血小板明显减少：原发或继发性血小板减少性紫癜 2 血小板功能异常： 血小板无力症； 3 严重缺乏血浆有关因子： vW病、DIC； 4 血管异常：遗传性出血性毛细血管扩张症； 5 药物影响： 乙酰水杨酸,血管性血友病因子抗原测定（vWF：Ag） 血管性血友病因子活性测定（vWF：Ag） 血浆凝血酶调节蛋白抗原测定（TM：Ag） 血浆内皮素-1测定(ET-1) 血浆 6-酮-前列腺素 F1测定 （PGI2的降解产物）,诊断试验,诊断试验,血管性血友病因子抗原测定（vWF：Ag） 血管性血友病因子活性测定（vWF：A）,血小板检测,一、血小板计数(platelet count,PC) 参考值： （100-300）109/L 检测方法： 显微镜计数 血细胞分析仪,筛检试验,1 减少：100109/L （1）生成障碍：再障、放射线损伤、白血病、骨髓纤维化等 （2）破坏或消耗增加： a 免疫破坏：血小板自身抗体、过敏性药物损伤 b 消耗亢进：DIC； c 血小板自身异常：先天性血小板减少症 2 增加：400109/L （1）原发增多：慢粒、真红细胞增多症、原发血小板增多症 （2）反应性增多：急慢性炎症、缺铁性贫血、肿瘤,临床意义：,二、血块收缩试验（clot retraction test，CRT） 原理：血液凝固后，血小板释放血栓退缩蛋白，使纤维蛋白网退缩，挤出血清。 与血小板质、量，纤维蛋白原的质、量，其他凝血因子的质、量，纤溶功能有关,血清析出,血小板功能 纤维蛋白原 数量 血浆异常蛋 白,影响因素,CRT (clot retraction test),参考值： 血块收缩率=析出血清量/全血量（100%-Hct%） 100% 参考值：65.8 11.0% 临床意义： 退缩率下降见于 1 血小板减少：Plt50 109/L ； 2 血小板功能异常：血小板无力症； 3 严重凝血因子异常：VIII 缺乏； 4 纤维蛋白原或凝血酶原显著降低,血小板相关免疫球蛋白 血小板粘附试验 血小板聚集试验 血小板激活的分子标志物 1、-血小板球蛋白（ -TG） 血小板第4因子（PF4）测定 2、P-选择素 3、血浆血栓烷B2（TXB2）测定,诊断试验,（一）血小板相关免疫球蛋白测定 （platelet associated immunoglobulin, PAIg） PAIgG、PAIgM和PAIgA ELISA法测定 PAIg增高，见于ITP、同种免疫性血小板减少性紫 癫及药物免疫性血小板减少性紫癫等。,（二）血小板粘附试验,计算： 临床意义： 见于血管性血友病，巨PLT综合征，BM增生，抑制剂使用 见于高凝状态，血栓病,（platelet adhesion test, PAdT）,粘附前PLT-粘附后PLT,粘附率=,粘附前PLT,诊断试,（三）血小板聚集试验,原理： 诱聚剂 PRP PAgT 临床意义： 见于血小板无力症，尿毒症，BM增生，plt抑制剂使用 见于高凝状态，血栓病,透光度,ADP，肾上腺素，凝血酶，胶原，花生四烯酸，瑞斯托霉素,（platelet aggregation test, PAgT）,Tests of thrombus and haemostasis,诊断试验,（四） 血小板激活的分子标志物 1、-血小板球蛋白（ -TG） 血小板第4因子（PF4）测定 2、P-选择素(P- selectin, GMP-140) 3、血浆血栓烷B2（TXB2）测定,凝血功能检测,1.外源性凝血途径的综合检查 血浆凝血酶原时间（Prothrombin Time, PT） 2.内源性凝血途径的综合检查 活化部分凝血活酶时间 （Activated Partial Thromboplastin Time, APTT）,筛检试验,Sysmex CA7000,PT 原理,in Blood,in Plasma,PT Reagent,Fibrin,Extrinsic System,Measure Clotting Time,without,Tissue Factor,Calcium (Ca2+),without,without,Normal Range 11-13 sec,37癈,Ca2+, PL,Ca2+, PL,Blood Sampling,Trisodium Citrate,一、PT实验结果报告形式 PT时间：11-13s，超过 3s为异常 PT比值（PTR）：10.05 国际标准化比值（INR）：PTRISI，10.1 二、临床意义： PT延长 外源及共同途径凝血因子异常 先天性或获得性（DIC、Vit K缺乏，肝病等） PT缩短 高凝状态、多发性骨髓瘤等,三、PT试验的临床应用 口服抗凝剂的监测 （INR最好在2.0-3.0） 肝疾患严重程度的分类 维生素K缺乏 DIC诊断标准 外源性途径出血筛选 手术前常规检查,APTT原理,in Blood,in Plasma,without,without,without,APTT Reagent,Activator,PL,Intrinsic System,Measure Clotting Time,Ellagic acid, silica etc.,Calcium (Ca2+),Normal Range 32-43 sec,CaCl2,Phospholipid,Fibrin,37癈,Ca2+, PL,Ca2+, PL,Blood Sampling,Trisodium Citrate,一、APTT试剂组成 磷脂：经氯仿或乙醚浸提的组织凝血活酶 接触因子激活物：白陶土、鞣花酸等 二、参考值 32-43s，延长10秒以上为异常,三、临床意义 APTT延长 内源性及共同通路凝血因子缺乏 1 先天性凝血因子异常：甲、乙型血友病等 2 后天性多种凝血因子缺乏：严重肝病、 DIC 等 3 循环抗凝物增加：SLE APTT缩短 DIC、妊高征等高凝状态,2019/8/30,42,可编辑,四、APTT测定的临床应用 * 肝素治疗的监测的理想实验 APTT比(1.5-2.5) * 血友病的筛选：血友病甲、乙，APTT明显延长 * DIC的诊断 * 内源凝血因子异常的筛选 * 血栓倾向的诊断 * 手术前常规(代替凝血时间) * 抗凝物质的检测,纤维蛋白原浓度测定（Fbg) 凝血因子VIII、IX、XI、XII活性测定 凝血因子II、V、VII、X活性测定 凝血因子XIII定性试验 凝血酶生成分子标志物,诊断试验,Fbg 测定原理(Clauss Method),in Blood,in Plasma,without,without,without,Fbg Reagent,Fibrin,Measurement Clotting Time,Thrombin,Normal Range 200-400 mg/dL,Calculated for Fibrinogen concentration,37,Blood Sampling,Trisodium Citrate,纤维蛋白原测定的临床应用,1 FIB参考值：2 - 4 g/L 2 纤维蛋白原含量增高 判定血栓前状态或血栓性疾病的必查项目， 常见疾病如脑血栓形成、心肌梗塞、结核、风湿病、肺炎、恶性肿瘤等 3 纤维蛋白原含量减少 a/肝脏疾病：慢性肝炎、肝硬化。 b/DIC诊断的重要筛选实验 c/溶栓治疗的监测 d/原发性纤维蛋白原缺乏症、原发性纤溶活性亢进、 恶性贫血及肺、甲状腺、子宫、前列腺手术等,凝血因子活性检测,血浆因子VIII、IX、XI、XII活性测定 原理：受检血浆分别加入乏因子VIII、IX、XI、XII因子的基质血浆，白陶土脑磷脂悬液和Ca2+，测APTT FVIII:C:103%25.7%, FIX:C:98.1%30.4% FXI:C:100%18.4%, FXII:C:92.420.7% 减低见于： FVIII:C：血友病甲（重型1%, 中型25%，轻型625%，亚临床型 2645%）；血管性血友病；VIII因子抗体、DIC FIX:C: 血友病乙；肝病、维生素K缺乏、DIC、口服抗凝剂 FXI:C: 因子XI缺乏、肝病、DIC FXII:C：先天性XII因子缺乏症、肝病、DIC 、某些血栓疾病,血浆因子、活性测定 原理：受检血浆分别与乏因子II、V、VII、X因子的基质血浆混合，再加兔脑粉浸出液和Ca2+，测PT FII:C:97.7%16.7%, FV:C:102.4%30.9% FVII:C:103%17.3%, FX:C:103%19.0% II:C 、V:C 、 VII:C 、 X:C 主要用于肝脏受损检查; VII:C 下降:肝病早期发生； V:C 在肝损伤、肝移植中应用较多,XIII因子定性试验 方法：纤维蛋白凝块置于5mol/L尿素溶液中 参考值：24h内纤维蛋白凝块不溶解 意义：XIII因子缺陷的筛查试验 24h内，尤其是2h内溶解，提示XIII因子缺乏 见于：先天性XIII因子缺乏症 肝病；SLE；DIC、原发性纤溶症； 转移性肝癌；恶性淋巴瘤,凝血酶生成分子标志物检测 F1+2（凝血酶原片段1+2） FPA （纤维蛋白肽A） SFMC（可溶性纤维蛋白单体复合物） TAT （凝血酶-抗凝血酶复合物）,凝血酶生成分子标志物检测原理,F 1+2：反映凝血酶生成总量及凝血酶原酶活性 凝血酶原 凝血酶 F1+2 FPA：代表凝血酶生成后对纤维蛋白原水解能力 纤维蛋白原 非连接性纤维蛋白单体 FPA、FPB SMFC：反映凝血酶作用后纤维蛋白单体的形成 TAT：反映凝血酶被抗凝血酶中和的程度,抗凝物质的检查,凝血酶时间（thrombin time, TT) 抗凝血酶III活性和抗原测定 蛋白C抗原、游离蛋白S测定 组织因子途径抑制物测定 肝素定量 狼疮抗凝物质,纤溶功能的检查,D-Dimer测定 纤维蛋白（原）降解产物 (FDP) 血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验（3P试验） 优球蛋白溶解时间 t-PA活性测定 PLG活性测定 PAI-1活性测定 2-PI:A活性测定 PAP测定 纤维蛋白肽B1-42和B15-42,正常值 阴性(乳胶凝集法) 0-256g/L（ELISA法）,？什麽是继发性纤溶 和原发性纤溶,D-D阴性是排除深静脉血栓（DVT）和肺血栓栓塞（PE）的重要试验,参考值 小于5mg/L,？ 什麽是FDP,FDP阳性或增高见于,原发性纤溶、DIC、血栓形成及溶栓等。,结果判断 阴性,也是鉴别继发性纤溶 与原发性纤溶的试验,阳性见于DIC的早、中期，假阳性见于恶性肿瘤、大出血、败血症、创伤、大手术等。 阴性见于正常人、晚期DIC和原发性纤溶症。,3P（plasma protamine paracoagulation test）,三、检验项目的选择和应用,一期止血缺陷的筛选试验 二期止血缺陷的筛选试验 DIC的实验诊断 抗凝与溶栓治疗的监测,1）皮肤、粘膜出血为主，内脏出血少见 2）创口即刻出血难止，持续时间不长 3）压迫止血有效，止血后不易复发 4）有遗传性和获得性,1一期止血缺陷特征: 指血管壁和血小板的缺陷,过敏性紫癜 发病机制： 变态反应 血管通透性或脆性增加 皮肤、粘膜出血 临床表现：单纯紫癜型、关节型、腹型、肾型、混合型,实验室检查： 1、血小板计数 正常 2、出血时间 正常 3、束臂试验 部分异常 4、凝血时间 正常 5、血小板功能试验 正常 6、尿常规检查 肾型或混合型可有 血尿、蛋白尿、管型尿,特发性血小板紫癜 idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP,实验室检查 1、血小板计数 急性型 20109/L 慢性型常为30-80109/L 2、束臂试验 阳性 3、血块退缩试验 回缩不良 4、出血时间 延长 5、血小板相关抗体和补体检查 阳性 6、血小板功能 减低 7、骨髓像 急性型：骨髓巨核细胞数轻度增加或正常，伴有成熟障碍，血小板产生型巨核细胞显著减少。 慢性型：骨髓巨核细胞数显著增多,一期止血缺陷的筛选试验： （1）BT延长，Plt减少：血小板减少性紫癜，分特发和继发性 （2）BT延长，Plt增多：血小板增多症，分原发和继发性 （3）BT延长，Plt正常：凝血因子缺乏（低纤维蛋白原血症、血管性血友病）；血小板功能异常（血小板无力症、 PF3缺乏症，贮存池病） （4）BT正常，Plt正常：血管壁异常（过敏性紫癜、遗传性出血性毛细血管扩张症等）,1）深部组织出血为主，内脏出血常见 2）创口延迟性出血难止，持续时间较长 3）输血制品有效，但易复发 4）有遗传性和获得性,2二期止血缺陷特征: 指凝血机制和抗凝机制缺陷,血友病甲,实验室检查： 1、血小板计数、出血时间、 凝血酶原时间 、凝血酶时间、vWF:Ag 正常 2、F:C活性和抗原测定：减低 4、APTT延长但可以被吸附血浆纠正,二期止血缺陷的筛选试验 凝血异常、抗凝物质 （1）APTT延长， PT正常 内源途径因子缺乏，VIII、IX、XI （2）APTT正常， PT延长 外源途径因子缺乏，VII （3）APTT延长， PT延长 共同途径因子缺乏，X、V、II、I缺乏，肝病、循环抗凝物质、DIC （4）APTT正常， PT正常 XIII因子遗传性或获得性缺乏,Tests of thrombus and haemostasis,二期止血缺陷,XIII,XIII,弥散性血管性凝血（DIC）的检查,一、概念： DIC（disseminated intravascular coagulation)是在原发病基础上，促凝因素导致机体微血管内广泛生成微血栓，消耗大量凝血因子和血小板，并伴以继发性纤溶为特征的获得性血栓-出血综合征，是许多疾病发病的一个中间环节和病理生理过程。基本症状包括广泛出血、循环衰竭、血栓栓塞、微血管病性溶血性贫血,二、DIC的产生机制,细胞破坏,组织损伤,组织因子,血管内皮损伤,激活血管内凝血因子,生成凝血酶,弥散性血管内凝血,血小板和凝血因子消耗