课件：地中海贫血的分子基础和产前诊断徐湘民.ppt

地中海贫血的 分子基础和产前诊断,徐湘民 南方医科大学基础医学院 School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University,北海， 2013年 8月23-25日,遗传性血红蛋白病 Inherited disorders of hemoglobin 异常血红蛋白 Abnormal hemoglobin, Structural variants 地中海贫血 (地贫) Thalassemias -thalassemia -thalassemia 遗传性持续性胎儿血红蛋白 Hereditary persistence of fetal hemoglobin(HPFH),血红蛋白病是世界上最常见的出生缺陷之一,全球每年约有790万出生缺陷患儿出生 5中常见的疾病占7000种出生缺陷的25% 血红蛋白病的发病率位于第三位,地中海贫血全球分布区域,中国南方高发地区 人群携带率3%-24%,Blood Rev, 2012.,全球血红蛋白病人群负荷,Blood, 2011; WHO Statistics, 2012.,中国异常血红蛋白调查,Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.,中国地中海贫血调查,Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.,Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.,中国地中海贫血调查,广东省地中海贫血的流行病学调查,J Clin Pathol, 2004.,西,北,东,南,8.53%,2.54%,地贫,地贫,正常人群 88.93,%,%,11种突变,12种突变,地贫携带者约1000万,广东地中海贫血流行病学调查,J Clin Pathol, 2004.,广西地区地中海贫血的流行病学调查,5,789人份,Clin Genet, 2010.,北,东,南,西, 汉族：3361 壮族：1670 瑶族： 619 其它： 139,正常人群 75.86%,17.55%,-地贫,6.43%,地贫,地贫,0.16%,正常人群 75.86,地贫 17.55%,%,%,9种突变,13种突变,广西地中海贫血流行病学调查,地贫携带者约1000万,Clin Genet, 2010.,高发区人群遗传负荷评估,中国南方血红蛋白病人群负荷,和地中海贫的分子基础, 常染色体隐性遗传病 致病基因：地贫 - 珠蛋白基因（16p13.3） 地贫 - 珠蛋白基因（11p15.3） 突变纯合子：重型地贫 - 致死 中间型地贫 - 致残 病理学基础： / 链比例失衡,和地贫的病理学机制和临床分类,-珠蛋白基因表达,-地中海贫血 临床综合征,正常 正常,-地中海贫血特征 -地中海贫血特征,Hb H 病 中间型-地中海贫血,Barts胎儿水肿综合征 重型-地中海贫血,-地中海贫血 临床综合征,-珠蛋白基因表达,珠蛋白链不平衡,16p13.3,11p15.3,地中海贫血的临床特征,小细胞低色素性溶血型贫血 (中、重度) 黄疸 肝脾肿大 (脾大明显) 骨髓扩增 发育迟缓 合并感染 Barts 水肿胎 (地贫,宫内或出生后半小时内死亡),地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症,地中海贫血的血液学表型特征 RBC 参数 MCV MCH 细胞形态变化 Hb 成分分析 Hb A2 () 或 () Hb Barts Hb H () Hb E (),1 2 3 4 5,Normal AA2 AE Barts AF HA,+,-,500V, 25min,血红蛋白电泳图谱,1. 正常人Hb 2. 轻型地贫 3. 异常Hb E杂合子 4. 新生儿Hb Barts (4, 地贫标准型） 5. Hb H,中间型地贫的临床特征, 轻度黄疸 肝脾肿大(脾大明显) 骨髓扩增 合并感染,不需进行常规输血治疗,血红蛋白水平维持在60-100g/L水平,发病年龄在2岁以后, 或成年期发病,中间型地贫的临床特征, 轻度黄疸 肝脾肿大 (脾大明显) 骨髓扩增 合并感染,不需进行常规输血治疗,血红蛋白水平维持在60-100g/L水平,发病年龄在2岁以后, 或成年期发病,重型地贫,重型地贫,中间型地贫,地贫是严重致死、致残性遗传性血液病,地中海贫血的防治对策 重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题 通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病 预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求,地中海贫血的预防控制,TIF Publication, 2003.,地中海贫血的研究策略,建立一系列诊断 标准和诊断技术,遗传流行病学 调查,大人群监控和 预防,用于基因分型,用于产前诊断,指导制定计划,和地贫发生的分子遗传学机制, -珠蛋白基因缺失, 中间型地贫: 复杂变异, -珠蛋白基因点突变,和地贫发生的分子遗传学机制, -珠蛋白基因缺失, 中间型地贫:复杂变异, -珠蛋白基因点突变,13种导致中国人-地中海贫血的缺失突变,地中海贫血预防控制操作指南. 人民军医出版社, 2011.,地中海贫血表型和基因型的关系,12种见于中国人群的导致 2/1珠蛋白基因表达降低的突变,地中海贫血预防控制操作指南. 人民军医出版社, 2011.,中国南方人群不同基因型Hb H病的分布,Unpublished Data, 2012.,/ /3.7 /4.2 WS/ CS/ QS/ SEA/ THAI/ / /3.7 /4.2 WS/ CS/ QS/ SEA/ THAI/,中国人主要-珠蛋白基因型与血液学表型的关系,Unpublished Data, 2012.,和地贫发生的分子遗传学机制, -珠蛋白基因缺失, 中间型地贫:复杂变异, -珠蛋白基因点突变,和地贫发生的分子遗传学机制, -珠蛋白基因缺失, 中间型地贫:复杂变异, -珠蛋白基因点突变,50 种见于中国南方的导致 珠蛋白基因表达降低的突变,地中海贫血预防控制操作指南. 人民军医出版社, 2011.,导致中国人群中间型的+地贫突变,6种引起地中海贫血的基因缺失,地中海贫血预防控制操作指南. 人民军医出版社, 2011.,和地贫发生的分子遗传学机制, -珠蛋白基因缺失, 中间型地贫:复杂变异, -珠蛋白基因点突变,2019/8/31,40,可编辑,和地贫发生的分子遗传学机制, -珠蛋白基因缺失, 中间型地贫:复杂变异, -珠蛋白基因点突变,产前基因诊断：地贫预防的技术基础, 人群携带者筛查发现高风险家庭 基于DNA分析的胎儿基因型诊断 胎儿取样 家系分析,产前基因诊断：地贫预防的技术基础, 人群携带者筛查发现高风险家庭 基于DNA分析的胎儿基因型诊断 胎儿取样 家系分析,用于携带者检测的表型分析方法 全血细胞计数 MCV (80fL) MCH (27pg) 血红蛋白分析 (电泳/HPLC) Hb A2 () or () Hb F () Hb Barts () Hb CS () Hb E () 免疫学定性检测 东南亚缺失型地贫链 (阳性),地中海血贫携带者筛查及产前诊断流程,产前基因诊断：地贫预防的技术基础, 人群携带者筛查发现高风险家庭 基于DNA分析的胎儿基因型诊断 胎儿取样 家系分析,产前基因诊断：地贫预防的技术基础, 人群携带者筛查发现高风险家庭 基于DNA分析的胎儿基因型诊断 胎儿取样 家系分析,羊膜穿刺(amniocentesis)抽取胎儿样品示意图,Gap-PCR技术用于-地贫的产前诊断,家系分析：RDB用于-地贫的产前诊断,基于DNA分析的检测策略, DNA分析需在血液学表型结果的指导下进行 DNA分析需优先针对种族特异性常见的突变,血液学分析指导血红蛋白病诊断的一般原则,用于 和 地贫临床基因分型的实验室流程,中国南方发现的5种占人群90%的常见 地中海贫血基因突变,地中海贫血的DNA诊断,-地贫:基因缺失分析技术,-地贫:基因点突变分析技术, Reverse Dot Blot （RDB）: 反向点杂交 probe melting curve-based genotyping assay （PMCA）: 基于探针熔解曲线的基因分型, Gap-PCR : 缺口PCR Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification （MLPA）: 多重连接探针扩增 检测基因拷贝数的荧光定量PCR,目前已获准或正在申报产品注册证的 检测中国人地贫突变的分子诊断技术,3种缺失型地贫检测试剂盒：单管多重gap-PCR法 17种地贫突变检测试剂盒：反向点杂交法 多位点缺失型地贫检测试剂盒： PCR荧光探针法 25 种地贫突变检测试剂盒：荧光PCR熔解曲线法,检测基因拷贝数的荧光定量 PCR,拷贝数相对定量诊断模型,1 基因 2个拷贝,看家基因 2个拷贝,1 基因 1个拷贝,看家基因 2个拷贝,1 基因 0个拷贝,看家基因 2个拷贝,Ct值,Ct,0,1,PCR 扩增,三个靶基因拷贝数定量分析结果,J Mol Diagn. 2013.,864例样品定量诊断特异性评价,-SEA/, -3.7/ -4.2/等基因分型,-SEA, -3.7, -4.2 等单倍型分析,珠蛋白基因拷贝数,-地贫分子诊断: 临床表型与基因分型,基因缺失,基因缺失,基因缺失,Gap-PCR定性 检测基因缺失,待检人基因组DNA,-地贫定量与定性检测的比较,基因缺失,基因缺失,基因重复,PMCA检测原理及流程图,J Mol Diagn, 2011.,25种地贫突变熔解曲线图谱,与传统RDB检测方法的比较,和地中海贫血的预防计划 目前基于人群筛查的预防模式 扩展家系筛查计划 基于医院水平的预防计划 基于社区或行政区的预防计划,人群干预可以降低出生缺陷发生率, 世界卫生组织的出生缺陷“三级预防”策略 一级：婚前检查 二级：产前筛查和产前诊断 三级：患儿治疗 孕前和孕期干预是我国出生缺陷预防的重点 探索基于社区的出生缺陷预防模式,斗门区,金湾区,香洲区,斗门市妇幼保健院,唐家镇医院,香州区妇幼保健院,珠海市妇幼保健院,横琴医院,金湾区妇幼保健院,珠海市地中海贫血预防现场的二级网络模式,珠海市1998-2005人群筛查及产前诊断结果,1998-2005珠海市地贫婚前/产前筛查及产前诊断结果,产前诊断：98 例地贫 44 例地贫,14 例重型地贫,27 例Barts水肿儿和Hb H病,筛查发现的阳性孕妇或阳性夫妇 地贫 地贫 地贫 地贫 4.5% 2.3% 1.6% 0.7%,筛查阳性对象数: 6563对,4312 2251 103对 45对,中华医学遗传学杂志, 2008.,2010年，卫生部与广西政府合作开展由政府买单为民服务的“地中海贫血防治” 省部共建惠民工程 该工程计划在5年内将广西地贫患儿出生率下降50%,卫生部与广西共建卫生惠民工程： 广西地中海贫血防治计划,政府组织,公益宣传,技术培训, 南方医科大学：地贫实 验室技术骨干培训基地 卫生部举办9省市地贫防 控适宜技术师资培训班,广西地中海贫血防治计划培训教材,广西地区地贫